二代測(cè)序的建庫(kù)步驟⑤
五、文庫(kù)富集(可選步驟)
PCR富集:對(duì)于一些起始樣本量較少或者連接效率較低的情況,可能需要進(jìn)行PCR富集。利用與接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,增加文庫(kù)中目標(biāo)DNA片段的數(shù)量。在PCR反應(yīng)中,需要注意引物的設(shè)計(jì)要與接頭序列準(zhǔn)確匹配,并且要優(yōu)化PCR循環(huán)數(shù),避免過(guò)度擴(kuò)增導(dǎo)致文庫(kù)多樣性降低或引入PCR偏差。一般會(huì)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的PCR循環(huán)數(shù),例如從10-15個(gè)循環(huán)開(kāi)始嘗試,通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的量和質(zhì)量來(lái)調(diào)整循環(huán)數(shù)。 二代測(cè)序廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研發(fā)。廣西二代測(cè)序提供
一代、二代、三代測(cè)序的區(qū)別分別是什么?
一代測(cè)序是上世紀(jì)70年代由Sanger和Coulson開(kāi)創(chuàng)的DNA雙脫氧鏈終止法測(cè)序,也稱為Sanger測(cè)序。
二代測(cè)序技術(shù)(NGS)是為了改進(jìn)一代測(cè)序通量過(guò)低的問(wèn)題而出現(xiàn)的,能夠同時(shí)對(duì)上百萬(wàn)甚至數(shù)十億個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了大規(guī)模、高通量測(cè)序的目標(biāo)。
三代測(cè)序主要有兩種技術(shù)PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore 的納米孔單分子測(cè)序技術(shù),這兩種技術(shù)的測(cè)序讀長(zhǎng)都可以達(dá)到幾-kb的級(jí)別,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二代測(cè)序技術(shù)。 新疆二代測(cè)序應(yīng)用二代測(cè)序需要分析嗎?
二代測(cè)序技術(shù)在不同人群中的準(zhǔn)確性有何差異④
***性疾病患者
優(yōu)勢(shì):病原學(xué)二代測(cè)序可準(zhǔn)確檢測(cè)病原體的基因序**定病原體種類和基因型,為***性疾病的診斷和***提供依據(jù),在檢測(cè)罕見(jiàn)病原體、病毒***等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),有助于快速明確診斷,尤其是對(duì)于一些傳統(tǒng)檢測(cè)方法難以診斷的***性疾病,如不明原因的發(fā)熱、肺炎、腦膜炎等。
局限性:對(duì)于低豐度病原體,可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。樣本質(zhì)量、測(cè)序深度和數(shù)據(jù)分析方法等因素也會(huì)影響準(zhǔn)確性,若樣本中病原體含量低或雜質(zhì)多,可能導(dǎo)致檢測(cè)失敗或結(jié)果不準(zhǔn)確
什么樣本可以做二代測(cè)序?②
組織樣本
新鮮組織:如手術(shù)切除的**組織、活檢組織等。新鮮組織樣本中的細(xì)胞完整性較好,能夠提供高質(zhì)量的DNA和RNA。在**研究中,對(duì)新鮮**組織進(jìn)行全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等,可以深入了解**的基因突變、基因表達(dá)變化等情況。例如,在研究結(jié)直腸*的發(fā)病機(jī)制時(shí),對(duì)手術(shù)切除的結(jié)直腸*組織及其*旁組織進(jìn)行測(cè)序,比較兩者之間的差異,以發(fā)現(xiàn)**相關(guān)的基因變異和表達(dá)調(diào)控異常。
福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織:這是臨床上常用的保存組織樣本的方式。FFPE組織中的DNA和RNA會(huì)有一定程度的損傷和降解,但經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶崛『托迯?fù)處理后,仍然可以用于二代測(cè)序。在回顧性研究中,大量的FFPE組織存檔樣本可以被利用起來(lái)。例如,對(duì)多年前保存的乳腺*FFPE組織進(jìn)行測(cè)序,研究乳腺*的疾病進(jìn)展和***反應(yīng)相關(guān)的基因變化。 二代測(cè)序的使用場(chǎng)景都有哪些?
二代測(cè)序的建庫(kù)步驟④
四、接頭連接
接頭選擇:根據(jù)測(cè)序平臺(tái)的要求選擇合適的接頭。不同的二代測(cè)序平臺(tái)(如Illumina、IonTorrent等)有各自特定設(shè)計(jì)的接頭。這些接頭包含與測(cè)序平臺(tái)的流動(dòng)池(flowcell)表面互補(bǔ)的序列,用于將DNA片段固定在測(cè)序芯片上,還包含用于區(qū)分不同樣本的索引序列(index)等。
連接反應(yīng):使用DNA連接酶將接頭與DNA片段連接。T4DNA連接酶是常用的連接酶,它可以在ATP(三磷酸腺苷)存在下,將接頭的5'-磷酸基團(tuán)與DNA片段的3'-羥基形成磷酸二酯鍵,從而將接頭連接到DNA片段的兩端。連接反應(yīng)的條件(如溫度、連接酶的用量、反應(yīng)時(shí)間等)需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化,以確保較高的連接效率。 二代測(cè)序可以應(yīng)用在哪些方面?南京嘉安健達(dá)二代測(cè)序原理
二代測(cè)序的成本比一代測(cè)序高嗎?廣西二代測(cè)序提供
二代測(cè)序技術(shù)在不同人群中的準(zhǔn)確性有何差異③
孕婦及胎兒
優(yōu)勢(shì):無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPT)是二代測(cè)序技術(shù)用于孕期胎兒常見(jiàn)染色體非整倍體篩查的應(yīng)用,對(duì)于唐氏綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等染色體異常疾病的檢測(cè)準(zhǔn)確率分別能達(dá)到95%、85%、75%以上,明顯高于傳統(tǒng)血清學(xué)篩查。
局限性:孕婦外周血中胎兒游離DNA來(lái)源于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞,可能與胎兒實(shí)際情況不一致,導(dǎo)致假陽(yáng)性。母親若合并免疫疾病、凝血功能障礙等,會(huì)使外周血中游離DNA含量過(guò)高,掩蓋胎兒來(lái)源的游離DNA,造成假陰性510. 廣西二代測(cè)序提供