二代測(cè)序——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程（下）

測(cè)序

根據(jù)研究需求和預(yù)算選擇合適的測(cè)序平臺(tái)，如 Illumina 測(cè)序平臺(tái)。它的測(cè)序原理主要是邊合成邊測(cè)序（SBS）。在測(cè)序過(guò)程中，dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）帶有不同顏色的熒光標(biāo)記，當(dāng)新的 dNTP 加入到正在合成的 DNA 鏈時(shí)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)確定堿基類(lèi)型，從而讀取 cDN**段的序列。測(cè)序深度（覆蓋度）也是一個(gè)重要參數(shù)，一般來(lái)說(shuō)，測(cè)序深度越高，檢測(cè)到的低表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的概率就越大，但成本也會(huì)相應(yīng)增加。

數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)質(zhì)量控制是第一步，要去除低質(zhì)量的 reads（如含有較多不確定堿基 “N” 的 reads）和接頭序列。然后將高質(zhì)量的 reads 比對(duì)到參考基因組或轉(zhuǎn)錄組上，常用的比對(duì)軟件有 TopHat、STAR 等。在確定了 reads 的位置后，就可以計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量，常用的方法有 RPKM（Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）、FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments）等。此外，還可以進(jìn)行差異表達(dá)分析，找出在不同樣本條件下（如疾病組和健康組）表達(dá)量有***差異的轉(zhuǎn)錄本，用于后續(xù)的功能注釋和通路分析，了解這些轉(zhuǎn)錄本可能參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。 二代測(cè)序需要分析嗎？北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序

一代、二代、三代測(cè)序的區(qū)別分別是什么？

一代測(cè)序是上世紀(jì)70年代由Sanger和Coulson開(kāi)創(chuàng)的DNA雙脫氧鏈終止法測(cè)序，也稱(chēng)為Sanger測(cè)序。

二代測(cè)序技術(shù)(NGS)是為了改進(jìn)一代測(cè)序通量過(guò)低的問(wèn)題而出現(xiàn)的，能夠同時(shí)對(duì)上百萬(wàn)甚至數(shù)十億個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了大規(guī)模、高通量測(cè)序的目標(biāo)。

三代測(cè)序主要有兩種技術(shù)PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore 的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)，這兩種技術(shù)的測(cè)序讀長(zhǎng)都可以達(dá)到幾-kb的級(jí)別，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二代測(cè)序技術(shù)。 內(nèi)蒙古哪里有二代測(cè)序分析二代測(cè)序是2005年以后開(kāi)始的嗎？

關(guān)于二代測(cè)序的簡(jiǎn)介：

二代測(cè)序技術(shù)(Next-Generation Seguencing,NGS)也稱(chēng)為高通量測(cè)序技術(shù)，是一種能夠同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)甚至數(shù)十億個(gè) DNA片段進(jìn)行測(cè)序的方法。與傳統(tǒng)的桑格測(cè)序相比二代測(cè)序技術(shù)具有高通量、高準(zhǔn)確性、高靈敏度和低成本等優(yōu)勢(shì)。

二代測(cè)序技術(shù)在大幅提高了測(cè)序速度的同時(shí)，大幅度的降低了測(cè)序成本，保持了高準(zhǔn)確性，以前完成一個(gè)人類(lèi)基因組的測(cè)序需要3年時(shí)間，而使用二代測(cè)序技術(shù)則需要1周，但其序列讀長(zhǎng)方面比起一代測(cè)序技術(shù)則要短很多，大多只100bp-150bp。

二代測(cè)序——質(zhì)量控制類(lèi)問(wèn)題

如何評(píng)估二代測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量：主要通過(guò)一些質(zhì)量指標(biāo)來(lái)評(píng)估，如Q值（質(zhì)量值）分布，用于衡量每個(gè)堿基的測(cè)序質(zhì)量；堿基含量分布，檢查四種堿基的比例是否正常；GC含量分布，看是否與預(yù)期的基因組GC含量相符；序列重復(fù)度，評(píng)估數(shù)據(jù)中重復(fù)序列的比例；比對(duì)率，即測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)上的比例等。影響二代測(cè)序質(zhì)量的因素有哪些：樣本質(zhì)量是關(guān)鍵因素之一，如DNA的純度、完整性和濃度等會(huì)影響文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序結(jié)果；文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中的操作不當(dāng)，如片段化過(guò)度、接頭連接效率低等；測(cè)序儀器的性能和運(yùn)行狀態(tài)，包括試劑的質(zhì)量、測(cè)序芯片的質(zhì)量、儀器的校準(zhǔn)等；生物信息學(xué)分析過(guò)程中的參數(shù)設(shè)置和算法選擇也會(huì)對(duì)**終的結(jié)果質(zhì)量產(chǎn)生影響。 高通量測(cè)序是二代測(cè)序嗎？

一代、二代、三代測(cè)序的技術(shù)原理和技術(shù)特點(diǎn)分別是什么？

技術(shù)原理：

一代—雙脫氧終止法

二代—橋式PCR+4色熒光可逆終止+激光掃描成像

三代—PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)

技術(shù)特點(diǎn)：

一代—只能檢測(cè)序列一致的PCR產(chǎn)物；讀長(zhǎng)可以較長(zhǎng)，比如Sanger可以達(dá)到幾百bp；通量低，一次只能檢測(cè)少量的序列；成本低；

二代—可以并行測(cè)序；需要放大信號(hào)才能檢測(cè)；通量大，可以產(chǎn)生上G的reads；讀長(zhǎng)較短，一-般是固定的，比如50、100、150、250等；成本較高

三代：可以并行測(cè)序；不需要放大信號(hào)，對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行測(cè)序；通量大，比如SequelII平臺(tái)，一張芯片可以有800萬(wàn)個(gè)ZMW；讀長(zhǎng)較長(zhǎng)；測(cè)序精確度較差；成本高； 二代測(cè)序的優(yōu)勢(shì)是高靈敏度。新疆二代測(cè)序運(yùn)用

二代測(cè)序的原理是什么？北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序

二代測(cè)序——技術(shù)原理類(lèi)問(wèn)題

二代測(cè)序與一代測(cè)序的區(qū)別是什么：一代測(cè)序技術(shù)如Sanger測(cè)序，一次只能讀取一條DNA序列，通量低、速度慢、成本高，但準(zhǔn)確性高，適用于對(duì)少量基因片段的精確測(cè)序。而二代測(cè)序技術(shù)具有高通量、速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可以同時(shí)對(duì)大量DNA分子進(jìn)行測(cè)序，但在單個(gè)堿基的準(zhǔn)確性上稍低于一代測(cè)序，二者在不同的應(yīng)用場(chǎng)景中各有優(yōu)勢(shì)。二代測(cè)序有哪些主要的測(cè)序原理：主要包括邊合成邊測(cè)序和連接法測(cè)序。邊合成邊測(cè)序是在DNA聚合酶的作用下，逐個(gè)添加帶有熒光標(biāo)記的dNTP，通過(guò)檢測(cè)釋放的熒光信號(hào)來(lái)確定堿基序列；連接法測(cè)序則是利用DNA連接酶將寡核苷酸探針連接到模板DNA上，根據(jù)連接的探針序列來(lái)推斷模板DNA的堿基組成。 北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序