二代測序的建庫步驟③
三、末端修復(fù)和加A尾(以DNA文庫為例)
末端修復(fù):經(jīng)過片段化后的DNA末端可能是不平齊的,有5'-突出端或3'-突出端。末端修復(fù)反應(yīng)可以利用T4DNA聚合酶、Klenow片段等酶,將這些末端補(bǔ)平,使其成為平末端。T4DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,在合適的反應(yīng)緩沖液和dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)存在下,可以將突出的末端補(bǔ)平。
加A尾:在末端修復(fù)后的平末端DNA分子的3'-末端加上一個(gè)A堿基。這一步是為了后續(xù)連接帶有T-突出端的接頭做準(zhǔn)備,一般使用Klenow片段(3'→5'外切酶活性缺失)在dATP存在下進(jìn)行加A反應(yīng),這樣可以使DNA片段能夠高效地與帶有T-突出端的測序接頭連接。 二代測序是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測序技術(shù)。貴州嘉安健達(dá)二代測序運(yùn)用
什么樣本可以做二代測序?③
細(xì)胞樣本
培養(yǎng)細(xì)胞:包括各種原代培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞系。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中,對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行測序可以了解細(xì)胞的基因特征和功能變化。例如,在研究細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時(shí),對經(jīng)過特定刺激處理的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,以分析基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)情況。
脫落細(xì)胞:如痰液中的脫落細(xì)胞、尿液中的脫落細(xì)胞等。這些細(xì)胞可以用于某些疾病的篩查。例如,在肺*篩查中,對痰液中的脫落細(xì)胞進(jìn)行基因檢測,通過二代測序?qū)ふ曳?相關(guān)的基因突變,作為一種非侵入性的檢測方法。 寧夏哪里有二代測序運(yùn)用二代測序是一種能夠同時(shí)對數(shù)百萬甚至數(shù)十個(gè)億DNA片段進(jìn)行測序的方法。
二代測序——應(yīng)用領(lǐng)域類問題
二代測序在**研究中的應(yīng)用有哪些:可用于**的早期篩查,通過檢測血液中的循環(huán)**DNA;進(jìn)行**的診斷分型,確定**的基因突變特征;評估***效果,監(jiān)測***過程中腫瘤細(xì)胞的基因變化;預(yù)測**的預(yù)后,分析與預(yù)后相關(guān)的基因標(biāo)志物;還可用于尋找**的新靶點(diǎn),為靶向***藥物的研發(fā)提供依據(jù)。二代測序在遺傳病診斷中的優(yōu)勢和局限性:優(yōu)勢在于能夠快速、***地檢測基因組中的變異,包括單核苷酸變異、小插入缺失、拷貝數(shù)變異等,提高了遺傳病的診斷率。局限性在于對于復(fù)雜基因組區(qū)域的檢測可能存在困難,如高度重復(fù)序列區(qū)域;檢測到的變異需要進(jìn)一步的功能驗(yàn)證和臨床解讀,部分變異的致病性難以確定;此外,成本相對較高,對于一些罕見病的診斷,可能需要較大的樣本量和更深入的分析。
二代測序技術(shù)在不同人群中的準(zhǔn)確性有何差異③
孕婦及胎兒
優(yōu)勢:無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPT)是二代測序技術(shù)用于孕期胎兒常見染色體非整倍體篩查的應(yīng)用,對于唐氏綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等染色體異常疾病的檢測準(zhǔn)確率分別能達(dá)到95%、85%、75%以上,明顯高于傳統(tǒng)血清學(xué)篩查。
局限性:孕婦外周血中胎兒游離DNA來源于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞,可能與胎兒實(shí)際情況不一致,導(dǎo)致假陽性。母親若合并免疫疾病、凝血功能障礙等,會(huì)使外周血中游離DNA含量過高,掩蓋胎兒來源的游離DNA,造成假陰性510. 一代、二代、三代測序的區(qū)別是什么?
二代測序——技術(shù)原理類問題
二代測序與一代測序的區(qū)別是什么:一代測序技術(shù)如Sanger測序,一次只能讀取一條DNA序列,通量低、速度慢、成本高,但準(zhǔn)確性高,適用于對少量基因片段的精確測序。而二代測序技術(shù)具有高通量、速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn),可以同時(shí)對大量DNA分子進(jìn)行測序,但在單個(gè)堿基的準(zhǔn)確性上稍低于一代測序,二者在不同的應(yīng)用場景中各有優(yōu)勢。二代測序有哪些主要的測序原理:主要包括邊合成邊測序和連接法測序。邊合成邊測序是在DNA聚合酶的作用下,逐個(gè)添加帶有熒光標(biāo)記的dNTP,通過檢測釋放的熒光信號來確定堿基序列;連接法測序則是利用DNA連接酶將寡核苷酸探針連接到模板DNA上,根據(jù)連接的探針序列來推斷模板DNA的堿基組成。 二代測序使用的是哪種設(shè)備?長寧區(qū)二代測序運(yùn)用
RNA測序也是二代測序。貴州嘉安健達(dá)二代測序運(yùn)用
不同二代測序技術(shù)平臺的速度
Illumina 測序平臺:這是目前市場上應(yīng)用較為***的二代測序平臺之一,其測序速度較快。例如 Illumina NovaSeq 系列,一次運(yùn)行可以在 1-3 天內(nèi)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù),通量可達(dá)數(shù)億甚至數(shù)十億條讀長,能夠滿足大規(guī)模基因組學(xué)研究和臨床檢測的需求。
Roche 454 測序平臺:Roche 454 測序系統(tǒng)的測序速度也較快,其特點(diǎn)是測序片段比較長,高質(zhì)量的讀長能達(dá)到 400bp 左右,一次運(yùn)行可以在 24 小時(shí)左右完成對一定數(shù)量樣本的測序。
BGISEQ 系列:華大智造的 BGISEQ 系列測序儀在速度上也有出色表現(xiàn),如全球二代測序速度**快設(shè)備 E25 量產(chǎn),為快速測序提供了有力支持 貴州嘉安健達(dá)二代測序運(yùn)用