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二代測(cè)序的建庫(kù)步驟④
四、接頭連接
接頭選擇:根據(jù)測(cè)序平臺(tái)的要求選擇合適的接頭。不同的二代測(cè)序平臺(tái)(如Illumina、IonTorrent等)有各自特定設(shè)計(jì)的接頭。這些接頭包含與測(cè)序平臺(tái)的流動(dòng)池(flowcell)表面互補(bǔ)的序列,用于將DNA片段固定在測(cè)序芯片上,還包含用于區(qū)分不同樣本的索引序列(index)等。
連接反應(yīng):使用DNA連接酶將接頭與DNA片段連接。T4DNA連接酶是常用的連接酶,它可以在ATP(三磷酸腺苷)存在下,將接頭的5'-磷酸基團(tuán)與DNA片段的3'-羥基形成磷酸二酯鍵,從而將接頭連接到DNA片段的兩端。連接反應(yīng)的條件(如溫度、連接酶的用量、反應(yīng)時(shí)間等)需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化,以確保較高的連接效率。 二代測(cè)序又可以稱之為什么?四川嘉安健達(dá)二代測(cè)序應(yīng)用
二代測(cè)序——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程(上)
樣本采集和 RNA 提取
樣本采集需要考慮研究目的和樣本類型。例如,研究**組織的轉(zhuǎn)錄組,就要準(zhǔn)確獲取**組織樣本,同時(shí)比較好有對(duì)應(yīng)的正常組織作為對(duì)照。RNA 提取方法有多種,常用的如 Trizol 法,它可以有效地從細(xì)胞或組織中提取總 RNA,包括 mRNA、rRNA 和 tRNA 等。提取后的 RNA 質(zhì)量至關(guān)重要,需要通過瓊脂糖凝膠電泳或?qū)iT的 RNA 質(zhì)量檢測(cè)儀器來評(píng)估 RNA 的完整性和純度。
RNA 質(zhì)量檢測(cè)和定量
完整性方面,通常使用 RNA 完整性指數(shù)(RIN)來衡量。RIN 值越高(一般認(rèn)為 RIN > 7 是高質(zhì)量 RNA),說明 RNA 完整性越好。定量方法主要有紫外分光光度法和熒光定量法。紫外分光光度法可以通過測(cè)量 RNA 在 260nm 和 280nm 處的吸光度比值來估計(jì) RNA 純度,比值在 1.8 - 2.0 之間表示純度較好。熒光定量法則是使用專門的熒光染料(如 Qubit)來更準(zhǔn)確地測(cè)量 RNA 濃度。
文庫(kù)構(gòu)建
首先要進(jìn)行mRNA富集,一般使用帶有poly-T的磁珠來特異性地捕獲mRNA,因?yàn)檎婧松飉RNA的3'端都有poly-A尾巴。然后將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再通過超聲或酶切等方法將cDNA片段化,片段大小通常在幾百個(gè)堿基對(duì)左右。之后在片段兩端連接上測(cè)序接頭,經(jīng)過PCR擴(kuò)增來增加文庫(kù)的量,使其達(dá)到可以上機(jī)測(cè)序的要求。
山西二代測(cè)序技術(shù)二代測(cè)序的原理是什么?
二代測(cè)序技術(shù)的一些***研究進(jìn)展③
技術(shù)優(yōu)化與創(chuàng)新領(lǐng)域
測(cè)序準(zhǔn)確性提高:通過改進(jìn)測(cè)序試劑、優(yōu)化測(cè)序反應(yīng)條件以及開發(fā)更先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析算法,二代測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性不斷提升,能夠更可靠地檢測(cè)到低頻變異和復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異等。
成本進(jìn)一步降低:隨著技術(shù)的不斷成熟和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的加劇,二代測(cè)序的成本持續(xù)下降,使得更多的研究機(jī)構(gòu)和臨床實(shí)驗(yàn)室能夠廣泛應(yīng)用該技術(shù),推動(dòng)了基因組學(xué)研究和臨床診斷的發(fā)展。
法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域
遺傳標(biāo)記檢測(cè):現(xiàn)有的二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)能夠完成 STR 遺傳標(biāo)記、SNP 遺傳標(biāo)記、mtDNA 及 mRNA 等遺傳標(biāo)記的測(cè)序,為法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別、親緣關(guān)系鑒定等提供了更豐富、準(zhǔn)確的遺傳信息。
技術(shù)應(yīng)用挑戰(zhàn)與應(yīng)對(duì):測(cè)序試劑盒中部分遺傳標(biāo)記的優(yōu)化、針對(duì)中國(guó)人群測(cè)序需求的試劑盒開發(fā)、數(shù)據(jù)采信標(biāo)準(zhǔn)的制定、測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件的優(yōu)化以及與現(xiàn)有法醫(yī)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的對(duì)接等,是二代測(cè)序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵,相關(guān)研究正在不斷推進(jìn)以解決這些問題 。
二代測(cè)序——基因組測(cè)序該測(cè)幾個(gè)G?②
人類全外顯子組測(cè)序
人類全外顯子組*占基因組的1%-2%,大小約為30M-60M左右,但通常需要較高的測(cè)序深度來確保外顯子區(qū)域的變異檢測(cè)準(zhǔn)確性,一般測(cè)序深度在100X-200X之間,數(shù)據(jù)量大約在3G-12G左右。全外顯子組測(cè)序主要關(guān)注編碼蛋白質(zhì)的外顯子區(qū)域,能夠高效地檢測(cè)出與疾病相關(guān)的基因突變,常用于遺傳病的診斷、**基因突變篩查等研究。
動(dòng)植物基因組測(cè)序
常見動(dòng)植物:對(duì)于一些常見的動(dòng)植物物種,如水稻、小鼠等,其基因組大小與人類基因組相近或更小。全基因組測(cè)序時(shí),測(cè)序深度一般在10X-30X左右,數(shù)據(jù)量在30G-90G之間。如果是進(jìn)行重測(cè)序或特定性狀相關(guān)的研究,測(cè)序深度可根據(jù)具體情況適當(dāng)調(diào)整。
復(fù)雜基因組的動(dòng)植物:部分動(dòng)植物的基因組較大且復(fù)雜,例如某些魚類、植物的多倍體物種等,其基因組大小可能達(dá)到數(shù)G甚至數(shù)十G。對(duì)于這類物種的全基因組測(cè)序,測(cè)序深度可能在5X-10X左右,數(shù)據(jù)量也會(huì)因基因組大小而異,從幾十G到數(shù)百G不等。 二代和三代測(cè)序的區(qū)別?
二代測(cè)序—全外顯子測(cè)序的優(yōu)勢(shì)
針對(duì)性強(qiáng):它主要聚焦于基因組中編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域,這部分區(qū)域雖然只占整個(gè)基因組的 1 - 2% 左右,但包含了大部分與疾病相關(guān)的突變。例如,在研究孟德爾遺傳病時(shí),很多致病突變都位于外顯子區(qū)域,通過全外顯子測(cè)序可以更高效地找到這些突變。
成本效益高:相比于全基因組測(cè)序,全外顯子測(cè)序的成本相對(duì)較低。因?yàn)樗恍枰獙?duì)整個(gè)基因組(包括大量的非編碼區(qū)域)進(jìn)行測(cè)序,在一定程度上減少了數(shù)據(jù)量和測(cè)序成本,同時(shí)又能獲取大部分有重要功能意義的遺傳信息。 二代測(cè)序產(chǎn)出的數(shù)據(jù)量有多少?什么是二代測(cè)序
單細(xì)胞測(cè)序?qū)儆诙鷾y(cè)序嗎?四川嘉安健達(dá)二代測(cè)序應(yīng)用
什么樣本可以做二代測(cè)序?②
組織樣本
新鮮組織:如手術(shù)切除的**組織、活檢組織等。新鮮組織樣本中的細(xì)胞完整性較好,能夠提供高質(zhì)量的DNA和RNA。在**研究中,對(duì)新鮮**組織進(jìn)行全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等,可以深入了解**的基因突變、基因表達(dá)變化等情況。例如,在研究結(jié)直腸*的發(fā)病機(jī)制時(shí),對(duì)手術(shù)切除的結(jié)直腸*組織及其*旁組織進(jìn)行測(cè)序,比較兩者之間的差異,以發(fā)現(xiàn)**相關(guān)的基因變異和表達(dá)調(diào)控異常。
福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織:這是臨床上常用的保存組織樣本的方式。FFPE組織中的DNA和RNA會(huì)有一定程度的損傷和降解,但經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶崛『托迯?fù)處理后,仍然可以用于二代測(cè)序。在回顧性研究中,大量的FFPE組織存檔樣本可以被利用起來。例如,對(duì)多年前保存的乳腺*FFPE組織進(jìn)行測(cè)序,研究乳腺*的疾病進(jìn)展和***反應(yīng)相關(guān)的基因變化。 四川嘉安健達(dá)二代測(cè)序應(yīng)用