PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的兼并引物PCR（DegeneratePrimer）介紹：兼并引物是指代替編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，產(chǎn)物特異性越強(qiáng)。設(shè)計引物時應(yīng)盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，因?yàn)?'端末尾3個堿基的退火足以在錯誤位點(diǎn)起始PCR；次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。因此，在引物設(shè)計時,比較選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3'端被兼并，因?yàn)?'端末尾3個堿基的退火足以在錯誤位點(diǎn)起始PCR;次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。實(shí)驗(yàn)證明，用脫氧肌苷引物進(jìn)行PCR,可以代替編碼蛋白的多種兼并密碼子中的兼并堿基。英瀚斯生物可承接臨床樣本、動物組織、細(xì)胞樣本各類pcr檢測。云南細(xì)胞pcr原理

PCR樣本可分2種，DNA樣本和RNA樣本。一，DNA樣本：已經(jīng)提取好的DNA樣本，負(fù)80度保存，干冰運(yùn)輸；血液樣本，需全血，加入抗凝劑，抗凝管4度保存；組織樣本，需凍存管或干凈滅菌的離心管裝，負(fù)80度保存，干冰運(yùn)輸；細(xì)胞樣本，用胰酶消化后的細(xì)胞沉淀，負(fù)20度或負(fù)80度保存。二，RNA樣本：提取好的RNA樣本，負(fù)80度保存，干冰運(yùn)輸；血液樣本，全血，加入抗凝劑，4度冰箱保存；組織樣本，凍存管或干凈滅菌離心管，負(fù)80度保存，干冰運(yùn)輸；細(xì)胞樣本，用胰酶消化后的細(xì)胞沉淀，負(fù)20度或負(fù)80度保存。長時間保存，可加Trizol，其中血液用TrizolLS組織和細(xì)胞沉淀用Trizol。湖北樣本pcr外包如何挑選pcr檢測試劑盒？

PCR設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC比較好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是較末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列比較好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處。⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以比較低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的RT-PCR一步法和兩步法的優(yōu)缺點(diǎn)介紹：一步法：利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴(kuò)增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化。所需樣品量減少到比較低限度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA.該法可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合，使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在單管中進(jìn)行。兩步法：由于單管反應(yīng)時RT和PCR都不能在比較好條件下進(jìn)行并且容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴(kuò)增較短的基因，及定量PCR.兩步法則是將RT和PCR分別進(jìn)行，這樣使得兩個反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點(diǎn)，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些GC含量、二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知模板，以及多個基因的RT-PCR。一步法熒光定量pcr在哪做？

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的Touch-downPCR介紹：Touch-downPCR又稱降落PCR.即選定一個溫度范圍，如50—35℃，每降1-2℃進(jìn)行1-2個循環(huán)，然后在50度下進(jìn)行15個循環(huán)。Touch-down的原理隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴(kuò)增出來，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。選擇初始復(fù)性溫度的原則起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的Tm值高出5-10度，然后每個循環(huán)遞減1-2度Touch-downPCR的應(yīng)用范圍lowcopyoftargetedDNA;highdegreedegeneracy(orlessspecific)ofthefirstsetofprimers;做pcr，樣本該如何保存？黑龍江什么是pcr哪家好

簡述熒光定量pcr的基本原理。云南細(xì)胞pcr原理

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的巢氏PCR（NestedPCR）介紹：巢氏PCR需要兩到三對引物，一般采用較為套引物擴(kuò)增15-30個循環(huán)，再用擴(kuò)增DNA的片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15-30個循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增，而次級結(jié)構(gòu)卻很少擴(kuò)增。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率。若將套失PCR的內(nèi)外引物稍加改變，延長外引物長度（25-30bp），同時縮短內(nèi)引物長度（15-17bp），使外引物先在高退火溫度下復(fù)性，做雙溫擴(kuò)增，然后改換至三溫循環(huán)，使內(nèi)引物在外引物擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，在低退火溫度復(fù)性，直到擴(kuò)增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入。云南細(xì)胞pcr原理

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