免疫組化分類中免疫酶標(biāo)方法，英瀚斯生物為您介紹。免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術(shù)。基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前定位準(zhǔn)確、對比度好、染色標(biāo)本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，目前在病理診斷中廣為使用的當(dāng)屬***法（過氧化物酶-抗過氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物）、SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶）、即用型二步法（聚合物鏈接）等。臨床樣本檢測，免疫組化，英瀚斯生物專業(yè)病理。湖南組織免疫組化檢測

免疫組化的結(jié)果分析：

免疫組化實(shí)驗(yàn)通常需要設(shè)置陽性對照、陰性對照（或替代對照）（陽性對照是排除方法和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有無問題；陰性對照與替代對照是排除有無非特異性染色）。一般情況下，陽性對照顏色的特點(diǎn)為：Ag定位，包漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。且染色的強(qiáng)度不同（顏色深淺不一）；陰性對照的特點(diǎn)為：染色細(xì)胞與組織無區(qū)別，顏色具有彌散性，分布均勻。

英瀚斯生物可承接各類病理染色，包括免疫組化。

說明：免疫組化實(shí)驗(yàn)可以對結(jié)果進(jìn)行定量分析，但要實(shí)驗(yàn)得到的必須是高質(zhì)量的染色切片，要求背景染色淺且特異性染色較深，這樣分析的結(jié)果才會(huì)比較準(zhǔn)確。 福建動(dòng)物組織免疫組化推薦做免疫組化需要多少錢？

實(shí)驗(yàn)失敗常見問題分析有哪些：

為什么在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)所有的切片都成陰性？

答：這種現(xiàn)象主要是由操作不當(dāng)導(dǎo)致，可能的原因有：1.染色操作不當(dāng)，致使染色失??；2.漏加一種抗體或者制備出的抗體沒有活性；3.緩沖液中有疊氮化鈉，抑制了酶的活性；4.復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)?shù)?。建議逐一排查，找到原因后重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)所有的切片都成陽性，這是為什么？答：與上一個(gè)問題類似，出現(xiàn)的原因也是試驗(yàn)操作存在問題，可能的原因有：1.切片在染色過程中抗體過濃，或者干片了；使用的呈色底物溶液已變色或呈色反應(yīng)時(shí)間過長；3.抗體溫育的時(shí)間過長等。

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)切片的背景很深，這是為什么？答：以下幾方面會(huì)導(dǎo)致切片的背景過深：1.蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血，造成抗體的非特異性反應(yīng)；2.內(nèi)源性過氧化酶沒有完全阻斷，顯色過程中過氧化酶與酶底物反應(yīng)，造成背景；3.底物呈色反應(yīng)時(shí)間過長或呈色反應(yīng)后漂洗不徹底。

病理醫(yī)師日常工作中經(jīng)常說的一句話應(yīng)該就是“做個(gè)免疫組化吧”；不管是臨床醫(yī)師，還是患者，他們問的多的問題則是“為什么要做免疫組化？”病理醫(yī)師通過“特殊染色”來進(jìn)行細(xì)胞的識(shí)別。這一做法的依據(jù)是特定細(xì)胞和組織中的成分不同、則化學(xué)性質(zhì)不同，通過染色的方法則可以呈現(xiàn)不同顏色。不過，由于組織固定或儲(chǔ)存等，會(huì)造成相應(yīng)物質(zhì)的活性降低甚至消失，因而限制了特殊染色方法的應(yīng)用。隨著免疫學(xué)研究的進(jìn)展，根據(jù)抗原與相應(yīng)抗體間特異性結(jié)合的性質(zhì)，則有了現(xiàn)在免疫組化的方法：不同細(xì)胞、不同組織中抗原有一定差異，抗體與被測組織中的特定抗原結(jié)合，進(jìn)而通過一定顯色方法將結(jié)合的抗體顯示出來。如有相應(yīng)顯色，則證實(shí)可能有被測抗原；無顯色則可能無被測抗原。當(dāng)然，這一方法中需注意相應(yīng)的“例外”，如抗體的非特異性結(jié)合、非特異性顯色，則容易造成“假陽性”；或者雖有相關(guān)抗原、但所用抗體與該抗原并未結(jié)合等，則容易造成“假陰性”。隨著免疫組化的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)的增加，這些問題在常規(guī)應(yīng)用中盡量得以避免，前者如各種顯色方法的優(yōu)化；后者如抗原修復(fù)方法的優(yōu)化、新型抗體開發(fā)及選擇。病理報(bào)告中的免疫組化到底有什么作用?

免疫組化結(jié)果背景染色較深的原因有哪些？

 （1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進(jìn)行染色。

（2）抗體孵育時(shí)間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，比較好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。 

（3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長：DAB比較好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色比較好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。但是當(dāng)染**太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過長。

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免疫組化應(yīng)該選擇石蠟切片還是冰凍切片？ 

（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是***我向一老師請教得出的結(jié)論。因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。

（2）冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當(dāng)你買一抗時(shí)，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。

（3）石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。

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