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干細(xì)胞提取試劑盒原理

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2023-03-22

AFC自動(dòng)收集器是將qEV分離法這一過(guò)程自動(dòng)化的儀器,將用來(lái)收集外泌體樣本的微量離心管放置在AFC的中間轉(zhuǎn)盤(pán)內(nèi),根據(jù)稱(chēng)重精確測(cè)量流體體積,可精確的測(cè)量到樣品中每一個(gè)液滴的重量并精確測(cè)量總重量。將在空隙體積之前從qEV柱洗脫的流體收集到AFC轉(zhuǎn)盤(pán)的單獨(dú)中心孔中并送至廢液桶,避免將不需要的空隙部分收集到微量離心管中。在提取期間,當(dāng)達(dá)到設(shè)定的提取體積后,轉(zhuǎn)盤(pán)會(huì)自動(dòng)旋轉(zhuǎn)到下一個(gè)微量離心管繼續(xù)收集,到收集完成后自動(dòng)停止。微滴式數(shù)字PCR技術(shù)不佳有效提高了核酸分子的擴(kuò)增效率,而且由于采用微滴計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行定量,可以不依賴(lài)與RT-PCR的熒光信號(hào)和Ct值,對(duì)所測(cè)樣品中的核酸分子進(jìn)行一定定量。在免疫系統(tǒng)中,據(jù)報(bào)道趨化因子受體CCR5通過(guò)外泌體在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移是細(xì)胞人類(lèi)免疫缺陷病毒傳染的一種機(jī)制。干細(xì)胞提取試劑盒原理

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血漿中的外泌體蛋白既可以當(dāng)作標(biāo)志物,也可以進(jìn)行機(jī)理研究?首先,研究人員將慢性淋巴瘤(CLL)患者分為2個(gè)亞組:疾病進(jìn)展期和疾病慢性期。然后利用質(zhì)譜技術(shù)分析了患者血漿外泌體蛋白組,發(fā)現(xiàn)S100-A9蛋白在進(jìn)展期CLL患者中明顯高表達(dá),可以作為CLL進(jìn)展期診斷的輔助標(biāo)志物。進(jìn)一步,研究人員通過(guò)生信分析發(fā)現(xiàn)進(jìn)展期CLL患者外泌體中的高表達(dá)蛋白質(zhì)主要與炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān),而NF-κB通路正是承接此效應(yīng)的關(guān)鍵通路。通過(guò)從進(jìn)展期CLL患者中分離富含S100-A9蛋白的外泌體加入CLL患者的PBMC細(xì)胞中,證實(shí)了S100-A9+外泌體能夠明顯促進(jìn)進(jìn)展期CLL患者PBMC細(xì)胞中IκBα蛋白的磷酸化上調(diào),進(jìn)一步活躍NF-κB通路。該研究證通過(guò)血漿外泌體蛋白組分析不只找到輔助診斷進(jìn)展期CLL的標(biāo)志物,并證實(shí)了S100-A9+外泌體可通過(guò)形成正向反饋調(diào)控,不斷活躍進(jìn)展期CLL患者自身PBMC細(xì)胞中的NF-κB通路,促進(jìn)CLL進(jìn)展的特殊機(jī)理。細(xì)胞外囊泡研究進(jìn)展采用電子顯微鏡檢測(cè)外泌體時(shí)對(duì)樣品的預(yù)處理和制備要求較高,外泌體的提取方法和品質(zhì)會(huì)對(duì)電鏡結(jié)果造成影響。

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近年來(lái),外泌體的捕獲技術(shù)越來(lái)越多,微流體系也被用于外泌體提取,此方法能根據(jù)其物理和生化特性同時(shí)分離外泌體。采用這種方法獲得的樣品純度高,且可及時(shí)獲取外泌體用于疾病的相關(guān)檢測(cè)。在初次注射時(shí)外泌體粘附在微流控設(shè)備的內(nèi)表面,并在隨后的PBS注射中沖洗掉。此方法采用的設(shè)備復(fù)雜,所需的樣本量取決于流動(dòng)通道的長(zhǎng)度。另外,樣品量的注入速率比較低,因此,對(duì)于大樣品量,將需要較長(zhǎng)的處理時(shí)間。外泌體在包括瘤子在內(nèi)的各種疾病的發(fā)病機(jī)理中具有重要的功能。目前,研究人員已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種方法來(lái)分離外泌體,離心技術(shù)仍然是常用方法,其他方法,例如過(guò)濾、磁珠分離和色譜法等,也顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),但目前仍然沒(méi)有一種公認(rèn)有效的提取方法,研究人員應(yīng)針對(duì)不同來(lái)源的樣本以及不同的下游分析選取較適宜的提取方案。

免疫印跡或蛋白質(zhì)印跡是分析外泌體較常用的方法之一,其原理是外泌體上特異性抗原與抗體結(jié)合。首先對(duì)樣品進(jìn)行處理將囊泡裂解并將蛋白質(zhì)變性,變性后,通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上并暴露于針對(duì)目的抗原的抗體中。抗體特異性識(shí)別膜表面上的抗原,然后將膜暴露于第二抗體中。通過(guò)二抗的熒光標(biāo)簽或與二抗偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶基團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)。常用的標(biāo)記蛋白為CD63、CD81、TSG101和ALIX等。但是此方法的特異性和重復(fù)性會(huì)受到所用抗體質(zhì)量的限制。外泌體的直徑比微泡的要小,后者直徑為100nm-1μm。外泌體產(chǎn)生相關(guān)的重要分子:Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。

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細(xì)胞外小泡通過(guò)充當(dāng)脂肪組織、肝臟、骨骼肌和免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊方式,在肥胖及其代謝并發(fā)癥的發(fā)展中發(fā)揮作用。外泌體可能在外周胰島素敏感性的調(diào)節(jié)中起作用,外周胰島素敏感性是T2D發(fā)病機(jī)理的主要組成部分。外泌體似乎通過(guò)至少兩種不同的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)胰島素敏感性,即通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥或通過(guò)與胰島素反應(yīng)性部位的直接相互作用。后者可通過(guò)與主要胰島素信號(hào)分子(例如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號(hào)通路)相互作用而影響胰島素信號(hào)通路而直接或間接發(fā)生。與對(duì)照組相比,糖尿病患者的血漿EV含量更高,并且與對(duì)照組相比,糖尿病小鼠的血漿外泌體數(shù)量也更高。然而,確定外泌體的作用及其在肝/腸軸通訊中的潛在作用將需要對(duì)它們的組成有更好的了解,特別是飲食是否會(huì)改變腸源性外泌體的含量,因此就胰島素反應(yīng)而言它們的生物學(xué)功能尚未研究。外泌體可由間充質(zhì)干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和瘤子細(xì)胞等多種類(lèi)型細(xì)胞主動(dòng)分泌釋放。外泌體nta檢測(cè)步驟

外泌體顯示出了在診療各種疾?。ㄈ缧募〔『蜕窠?jīng)病)方面的潛力。干細(xì)胞提取試劑盒原理

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA):將其中一種針對(duì)外泌體表面抗原的抗體固定在微孔板的表面上,將外泌體樣品暴露于含有固定抗體的孔中,由于抗體-抗原相互作用,表達(dá)抗原的外泌體將被捕獲固定在板上。將未捕獲的樣品內(nèi)容物洗掉,并使用另一種抗體檢測(cè)固定的外泌體。ELISA已用于從尿液、血漿和血清中分離出外泌體,當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)液(已知外泌體的量)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),甚至可以進(jìn)行定量。但是,此方法需要通過(guò)超速離心或超濾對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。同樣,流場(chǎng)-流分離與紫外線分析儀和光散射檢測(cè)器相結(jié)合已被用于分析外泌體的大小和純度。外泌體屬于胞外囊泡類(lèi),除了外泌體之外細(xì)胞還分泌微泡以及其它的膜囊泡。干細(xì)胞提取試劑盒原理

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標(biāo)簽: 外泌體提取試劑盒