細(xì)胞外囊泡是蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和脂質(zhì)運(yùn)輸來完成細(xì)胞間通訊通路的重要媒介，根據(jù)它們的大小和發(fā)生分為三類，包括外泌體、微泡和凋亡小體。其中，外泌體是直徑大約為40-100nm的包裝囊泡，由多種細(xì)胞分泌，內(nèi)含有特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞因子或遺傳物質(zhì)。來源于不同的組織的外泌體不只具有其特異性蛋白分子，而且還包含其行使功能的關(guān)鍵分子。近年來，隨著外泌體研究的不斷深入，它的應(yīng)用已經(jīng)涉及瘤子診療領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域、寄生蟲領(lǐng)域；臨床研究上已涉及心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)等。超速離心是目前分離外泌體的主要技術(shù)。外泌體的直徑比微泡的要小，后者直徑為100nm-1μm。外泌體標(biāo)志物

外泌體研究背景：胞外囊泡是從細(xì)胞膜上脫落或者由細(xì)胞分泌的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，主要由微囊泡、凋亡小體、外泌體組成。而外泌體是其中一類小囊泡，直徑為30~150nm，密度1.10~1.18g/ml，可攜帶核酸、蛋白質(zhì)質(zhì)和脂質(zhì)等，存在于血液、唾液、尿液等多種體液中。越來越多的研究證實(shí)，外泌體可以通過細(xì)胞間轉(zhuǎn)移核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等特定物質(zhì)，發(fā)揮特殊的功能。如在抗原提呈細(xì)胞中呈遞抗原程中、腫細(xì)胞細(xì)胞發(fā)生了發(fā)展、神經(jīng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中都發(fā)揮著重要作用。對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預(yù)后分析。浙江外泌體label free外泌體膜含有MHC-1/2蛋白，能綁定特異性的肽鏈。

外泌體的生物發(fā)生和鑒定。液體和細(xì)胞外成分，如蛋白質(zhì)、脂類、代謝物、小分子和離子，可以通過內(nèi)吞作用和質(zhì)膜內(nèi)陷，與細(xì)胞表面蛋白一起進(jìn)入細(xì)胞。由此產(chǎn)生的胞腔側(cè)質(zhì)膜芽的形成表現(xiàn)為質(zhì)膜的外-內(nèi)取向。這一出芽過程導(dǎo)致芽的形成可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、跨高爾基網(wǎng)絡(luò)(TGN)和線粒體預(yù)先形成的早期核內(nèi)體融合。ESEs也可以與ER和TGN融合，這可能解釋了內(nèi)吞物如何到達(dá)它們的。因此，一些ESEs可以包含膜和腔的成分，可以表示不同的起源。外泌體表面蛋白包括四聚體蛋白、整合蛋白、免疫調(diào)節(jié)蛋白等。外泌體可以包含不同類型的細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞內(nèi)蛋白、RNA、DNA、氨基酸和代謝物。

內(nèi)化的外泌體和內(nèi)源性產(chǎn)生的外泌體的細(xì)胞旅程：外泌體可以通過不同的機(jī)制直接進(jìn)入細(xì)胞。外泌體由細(xì)胞通過內(nèi)吞作用過程從頭生成。外泌體不斷地被細(xì)胞產(chǎn)生和吸收。它們可能是新生成的外泌體和消耗的外泌體的混合物。目前尚不清楚內(nèi)生性產(chǎn)生或消耗的外泌體是一起釋放還是單獨(dú)釋放。被吸收的外泌體會被溶酶體降解。進(jìn)入細(xì)胞的外泌體可能進(jìn)入或與已存在的ESEs融合，隨后解體并將其內(nèi)容物釋放到細(xì)胞質(zhì)中。另外，內(nèi)泌體可以與質(zhì)膜融合并在細(xì)胞外釋放外泌體。外泌體的膜蛋白有可能與細(xì)胞膜蛋白作用，活躍細(xì)胞內(nèi)通路。

外泌體的提取分離的方法：1、超速離心法（差速離心）：超離法是較常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進(jìn)行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎，但過程比較費(fèi)時，且回收率不穩(wěn)定（可能與轉(zhuǎn)子類型有關(guān)），純度也受到質(zhì)疑；此外，重復(fù)離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質(zhì)量。2、密度梯度離心：在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高，但步驟繁瑣，耗時。磁珠免疫法分離的外泌體，生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實(shí)驗(yàn)，難以普遍普及。腦脊液外泌體鑒定

外泌體存在于組織樣本中，如腦組織、肌肉組織、脂肪組織等。外泌體標(biāo)志物

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）：將其中一種針對外泌體表面抗原的抗體固定在微孔板的表面上，將外泌體樣品暴露于含有固定抗體的孔中，由于抗體-抗原相互作用，表達(dá)抗原的外泌體將被捕獲固定在板上。將未捕獲的樣品內(nèi)容物洗掉，并使用另一種抗體檢測固定的外泌體。ELISA已用于從尿液、血漿和血清中分離出外泌體，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)液（已知外泌體的量）創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時，甚至可以進(jìn)行定量。但是，此方法需要通過超速離心或超濾對樣品進(jìn)行預(yù)處理。同樣，流場-流分離與紫外線分析儀和光散射檢測器相結(jié)合已被用于分析外泌體的大小和純度。外泌體標(biāo)志物

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