熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。免疫熒光測定：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法。免疫熒光實驗步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答。P21免疫熒光分析

免疫熒光的原理：免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。HIF-1a免疫熒光檢查免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病。

免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，會使熒光減弱。2）每次試驗時，需設(shè)置以下三種對照：①陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。

細(xì)胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘。7. 一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度，1-2小時。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。HIF-1a免疫熒光檢查

免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。P21免疫熒光分析

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、多肽、核酸、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測、免疫學(xué)、血型鑒定等。免疫熒光實驗步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次。封閉：使用封閉液對樣本進(jìn)行封閉，一般1h。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗：使用間接法時需要加二抗處理，根據(jù)說明書使用合適的濃度，避光處理1h（后面步驟均需避光）。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。封片：滴一滴防淬滅劑，封片?？闪⒓从^察后暫存4℃盡快觀察。P21免疫熒光分析

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