免疫熒光實驗步驟：1.樣本準備：細胞或薄組織。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。2.固定：取適當的固定劑固定樣本。一般用4%PFA固定4℃過夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進入細胞與抗原結合。早期的免疫熒光技術是將抗體與示蹤物質結合，用于定位組織或細胞內的抗原物質。VEGFR2免疫熒光IF

細胞的固定及免疫熒光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔內滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃，室溫避光孵育1小時。注意二抗帶有熒光素標記，因此操作過程盡量在暗處進行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst復染細胞核，一般為藍色熒光；避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結合較緊，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，注意選擇抗體對應的激發(fā)光源。LY6G免疫組化免疫熒光技術是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質的高度發(fā)達的標記免疫技術。

免疫熒光技術又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。免疫熒光技術是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記抗體獲得成功。經過幾十年的發(fā)展，該技術已相當成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術。在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所以人們習慣將熒光抗體技術稱為免疫熒光技術

熒光的產生：一此化學物質能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。免疫熒光技術是一種利用熒光物質標記抗體來定位抗原的技術。

細胞免疫熒光可以觀察蛋白在細胞中的定位，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進行細胞免疫熒光過程中，需要用到細胞爬片，通過將爬片浸在細胞培養(yǎng)基內，細胞在爬片上生長，進而進行細胞的免疫熒光。實驗前準備：1.胰酶;2.DMEM細胞培養(yǎng)基;3.細胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結合的二抗數量進行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質的高度發(fā)達的標記免疫技術。免疫熒光技術可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常。VEGFR2免疫熒光IF

免疫熒光技術可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。VEGFR2免疫熒光IF

zo-1的免疫熒光，步驟如下：1.細胞在蓋片上生長融合到95%-100%時，從孵箱中取出。2.用預溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘。6.1×PBS洗3次，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4度過夜。9.1×PBS洗3次，每次10分鐘。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光。11.1×PBS洗3次，每次10分鐘。12.95%甘油封片。注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋。VEGFR2免疫熒光IF

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