免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項：1）熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，會使熒光減弱。2）每次試驗時，需設置以下三種對照：①陽性對照：陽性血清+熒光標記物②陰性對照：陰性血清+熒光標記物③熒光標記物對照：PBS+熒光標記物3.已知抗原標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物，應始終保持在已知抗原標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。免疫熒光技術可以用于研究代謝疾病和內分泌系統(tǒng)的功能。VWF免疫

免疫熒光實驗的注意事項：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。③陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現象，經熒光染色的標本較好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。occludin免疫抗體熒光抗體技術可以用于檢測和定位細胞或組織中的特定抗原物質。

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響結果的觀察。染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數小時，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。

免疫熒光技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。熒光免疫法按反應體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產。由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應用。免疫熒光技術可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常。

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴散），固定液包括：有機溶劑（甲醇、乙醇等）；交聯劑（4%PFA、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質及所用抗體的特性，不過，目前甲醛用的還是較多的，但針對磷酸化的抗體，不適合用甲醛，會導致磷酸蛋白從膜表面轉移到胞漿中，故應選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇，同時應注意甲醛會揮發(fā)，在4-8°C不宜儲存太久。固定時間：取決于組合塊的大小和類型，對于大多數組織，18-24h較為理想，細胞固定時間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。免疫熒光技術可以通過熒光信號顯示和檢查細胞或組織內的抗原或半抗原物質。Glut1免疫熒光

熒光抗體技術具有高靈敏度和高特異性，可以實現精確的免疫檢測。VWF免疫

熒光的產生：一此化學物質能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現象也隨之在瞬間內消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。VWF免疫