熒光物質，熒光色素：許多物質都可產生熒光現象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質穩(wěn)定，可長期保存。結構式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結構式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。免疫熒光技術可以用于研究植物病理學和農業(yè)生產。NF200免疫組化IHC

細胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時候作的細胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖，不要細胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(避光)，或者37度1半小時，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂。LC3免疫組化IHC免疫熒光技術是基于免疫學、生物化學和顯微鏡技術的重要方法之一。

其他熒光物質：1．酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計、流式細胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡。

熒光的產生：一此化學物質能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現象也隨之在瞬間內消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。免疫熒光技術可以通過熒光信號顯示和檢查細胞或組織內的抗原或半抗原物質。

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴散），固定液包括：有機溶劑（甲醇、乙醇等）；交聯(lián)劑（4%PFA、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質及所用抗體的特性，不過，目前甲醛用的還是較多的，但針對磷酸化的抗體，不適合用甲醛，會導致磷酸蛋白從膜表面轉移到胞漿中，故應選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇，同時應注意甲醛會揮發(fā)，在4-8°C不宜儲存太久。固定時間：取決于組合塊的大小和類型，對于大多數組織，18-24h較為理想，細胞固定時間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。熒光抗體技術可用于檢測和定位各種抗原，也可以用于檢測和定位抗體。Fibronectin免疫熒光IF

免疫熒光技術在免疫學研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細胞和分子的功能和相互關系。NF200免疫組化IHC

細胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板），為后面照像打基礎。細胞密度適中，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片。2. 取出細胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現用現配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗，4度孵育過夜（找個小瓶蓋將小玻片支起來，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻。抗體稀釋度1：60，較常用！8. PBS沖洗4次，各5分鐘；9加入熒光二抗，室溫30分鐘?？贵w稀釋度1：400，較常用！10. 90%甘油封片。也很關鍵阿，多封幾次才有體會。12. 避光保存，或到顯微鏡下觀察。NF200免疫組化IHC