免疫熒光實驗的注意事項：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對照（抑制試驗）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽性對照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強熒光，則為特異性陽性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。PD-1免疫熒光試驗

熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。可以引起發(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。PD-1免疫熒光試驗免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細(xì)胞爬片時，動作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實驗進(jìn)程。（2）種細(xì)胞過程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長過密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。

免疫熒光通透（目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)），0.5%TritonX-100(一種去垢劑，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內(nèi)抗原，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟）；除了TritonX-100，也可作為通透劑，并且固定后的樣品不需要通透。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點進(jìn)行結(jié)合），通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系。

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后，采用熒光標(biāo)記，標(biāo)記完成后，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少，從而做出一個定位研究，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強、特異性高、速度快的特點，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù)，也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合，其次是帶有熒光基團的二抗識別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機制和醫(yī)治效果評估。PD-1免疫熒光試驗

免疫熒光技術(shù)可以同時檢測多個目標(biāo)分子，通過不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。PD-1免疫熒光試驗

檢測復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號，并將熒光信號從背景噪聲中分離開來。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于：需要精細(xì)調(diào)整樣品信號達(dá)到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù)。雖然熒光基團是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像的較佳選擇，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白，即熒光信號的光化學(xué)降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，產(chǎn)生假性結(jié)果?？勾銣绶馄瑒┛梢员Ｗo熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性，維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號完整度。PD-1免疫熒光試驗