熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490495nm，較大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結構式如下：有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質穩(wěn)定，可長期保存。結構式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。免疫熒光技術可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用。cyclinD1免疫組化

其他熒光物質：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計、流式細胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡。collagen3免疫熒光試驗免疫熒光細胞化學技術用于顯示和檢查細胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質。

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴散），固定液包括：有機溶劑（甲醇、乙醇等）；交聯(lián)劑（4%PFA、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質及所用抗體的特性，不過，目前甲醛用的還是較多的，但針對磷酸化的抗體，不適合用甲醛，會導致磷酸蛋白從膜表面轉移到胞漿中，故應選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇，同時應注意甲醛會揮發(fā)，在4-8°C不宜儲存太久。固定時間：取決于組合塊的大小和類型，對于大多數(shù)組織，18-24h較為理想，細胞固定時間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。

細胞免疫熒光實驗注意事項：1、建議細胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免然后挑片時造成劃片或細胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結果；2、若實驗室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細胞植于細胞爬片。建議直接購買處理過的細胞爬片；若只有普通細胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟。然后，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用。免疫熒光技術可以用于研究細胞內(nèi)蛋白質的定位和表達水平。

免疫熒光注意事項：對照實驗的設置：1、內(nèi)源性組織背景對照：某些細胞和組織可能有固有的生物學性質，會產(chǎn)生背景熒光，對結果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質。因此在孵育一抗前，應對樣品進行觀察，確保抗原本身沒有信號。2、陽性對照：用確認含有待測抗原的組織或細胞，與待測標本進行統(tǒng)一處理，結果應為陽性，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對照：與陽性對照相反，用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色，結果若為陰性，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結果。在實際工作中，熒光抗原技術應用較少，因此通常將其稱為熒光抗體技術或免疫熒光技術。collagen3免疫熒光試驗

免疫熒光技術可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。cyclinD1免疫組化

免疫熒光-實驗步驟：細胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。cyclinD1免疫組化