3.粘壁細(xì)胞的染色（1）使粘壁的細(xì)胞在無菌實驗室培養(yǎng)。（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。（4）在37℃培養(yǎng)細(xì)胞2～20分鐘，不同的細(xì)胞比較好培養(yǎng)時間不同。（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞，培養(yǎng)5～10分鐘，然后吸干培養(yǎng)基。

4.顯微鏡檢測（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器的選擇參見表1。（2）多色染料的同時檢測，濾光器按照以下設(shè)定：a)DiI和DiO＝OmegaXF52，Chroma51004；b)DiI和DiD＝OmegaXF92，Chroma51007；c)DiI，DiO和DiD＝OmegaXF93，Chroma61005

5.流式細(xì)胞儀的檢測DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染色的細(xì)胞可以分別用經(jīng)典的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和FL4流式細(xì)胞儀檢測。 Super Flour 系列在生物熒光領(lǐng)域已逐漸替代FITC,Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7等熒光染料。中國澳門熒光染料luciferin

1.DiD，DiO，DiI，DiR和DiS細(xì)胞膜染色液制備（1）配置DMSO或EtOH儲存液：儲存液用DMSO或EtOH配置濃度1～5mM。注意：未使用的儲存液保存在-20°C，避免反復(fù)凍融。（2）工作液制備：用合適的緩沖液（如：無血清培養(yǎng)基，HBSS或PBS）稀釋儲存液，配制濃度為1～5μM的工作液。注意：工作液的**終濃度是根據(jù)不同細(xì)胞和實驗的經(jīng)驗來配制?？梢詮耐扑]濃度的十倍以上尋找比較好條件。

2.懸浮細(xì)胞染色（1）懸浮細(xì)胞密度為1×106/mL加入到工作液中。（2）在37℃培養(yǎng)細(xì)胞2～20分鐘，不同的細(xì)胞比較好培養(yǎng)時間不同。（3）染色細(xì)胞試管在1000～1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。（4）傾倒上清液，再次緩慢加入預(yù)溫37℃的培養(yǎng)液。（5）重復(fù)（3），（4）步驟兩次以上。 江蘇光敏劑熒光染料目前常用標(biāo)記蛋白/抗體的熒光素主要有BODIPY類、香豆素類、羅丹明類、近紅外類、NBD胺類以及菁染料等。

Cy7DiC18（DiR）是一個親脂性、近紅外熒光花青染料。這個染料常用于標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)膜。Cy7DiC18（DiR）的兩個18-碳鏈插入到細(xì)胞膜，從而進(jìn)行特定的、穩(wěn)定的細(xì)胞染色，幾乎不會發(fā)生細(xì)胞間的染料轉(zhuǎn)移。Cy7DiC18（DiR）（近紅外熒光）和其他細(xì)胞膜熒光染料如DiI（橙色熒光），DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）配合使用，為多色成像和流式細(xì)胞分析提供了有效的工具。Cy7DiC18（DiR）染色后可進(jìn)行多聚甲醛（不可使用甲醇等其他試劑）的固定，但不建議在染色后進(jìn)行透化的過程。此外，在固定透化（室溫下用0.1%TritonX-100透化）后，也可以很好地進(jìn)行質(zhì)膜染色。

1、Cy7DiC18（DiR）染色固定的細(xì)胞或組織樣品時，通常使用配制在PBS中的4%多聚甲醛進(jìn)行固定，使用其它不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簳?dǎo)致熒光背景較高。

2、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

CY5.5-NHS熒光染料是一種廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記和成像的熒光染料，CY5.5-NHS熒光染料具有優(yōu)異的熒光性能。其激發(fā)波長約為675nm，發(fā)射波長約為695nm，位于紅色光譜區(qū)域，這使得它在生物樣本中具有較強(qiáng)的穿透力，能夠深入組織內(nèi)部進(jìn)行標(biāo)記和成像。此外，CY5.5-NHS熒光染料具有較高的熒光量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性，可以在較長時間的激發(fā)下保持穩(wěn)定的熒光信號，從而確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。CY5.5-NHS熒光染料作為一種***的熒光染料，在生物科學(xué)研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。其優(yōu)異的熒光性能、良好的生物相容性、***的適用范圍以及易于合成和修飾的優(yōu)點，使得它成為生物醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的重要工具。DAPI染色液（DAPI Staining Solution）常用于細(xì)胞核染色，可將細(xì)胞核染成藍(lán)色。

三、流式細(xì)胞儀分析1、取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種到孔板，過夜培養(yǎng)。2、如果要進(jìn)行藥物刺激，在細(xì)胞中加入感興趣的藥物進(jìn)行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，收集細(xì)胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重懸細(xì)胞，37℃避光孵育15min或更長時間?！咀⒁狻浚河捎诩?xì)胞種類和實驗體系不同，Rhodamine123工作液濃度和孵育時間可以根據(jù)預(yù)實驗或參考文獻(xiàn)自行調(diào)整。4、用流式細(xì)胞儀檢測。

四、實驗案例1、取對數(shù)生長期A549細(xì)胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基）,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁，以便后續(xù)實驗操作.2、棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次.3、用培養(yǎng)基（無血清）稀釋Rh123母液制備1～20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。4、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細(xì)胞去除背景色.6、熒光顯微鏡觀察. CY7 是一種 CY 染料。CY 為花菁 (Cyanine) 的縮寫，是由奇數(shù)個甲基單元連接的兩個氮原子組成的化合物。南京熒光染料細(xì)胞核

羅丹明具有出色的光穩(wěn)定性以及許多光物理特性，使其非常適合用作激光染料、熒光探針和顏料。中國澳門熒光染料luciferin

所需的CY3-NHS酯的量取決于待標(biāo)記蛋白的量，以及CY3-NHS的比較好摩爾比為10。示例：假設(shè)所需的標(biāo)記蛋白為500μL2mg/mLIgG(MW=150,000)，用100μLDMSO溶解1mgCY3-NHS酯，得到所需的CY3-NHS酯體積為5.05μL，詳細(xì)計算過程如下：1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG)=2mg/mL×0.5mL/150，000mg/mmol=6.7×10-6mmol2)mmol(CY3-NHS酯)=mmol(IgG)×10=6.7×10-6mmol×10=6.7×10-5mmol3)uL(CY3-NHS酯)=mmol(CY3-NHS酯)×MW(CY3-NHS酯)/mg/μL(CY3-NHS酯)=6.7×10-5mmol×753.88mg/mmol/0.01mg/μL=5.05μL(CY3-NHS酯)4.運行偶聯(lián)反應(yīng)1)將室溫新鮮制備的10mg/mLCY3-NHS酯緩慢加入到0.5mL蛋白質(zhì)樣品中于溶液中，輕輕搖動混勻，然后短暫離心，將樣品收集于反應(yīng)管底部。請勿混勻，否則2)將反應(yīng)管安置避光處，在接下來的間隔輕輕蛋白水解60分鐘。10-15分鐘，輕輕翻轉(zhuǎn)幾次以充分混合5.偶聯(lián)偶聯(lián)物以下方案是使用SepHadexG-25柱封閉染料-偶聯(lián)偶聯(lián)物的范例。1)根據(jù)制造說明準(zhǔn)備SepHadexG-25柱。2)將反應(yīng)混合物(來自“Runconjugationreaction”)加載到SepHadexG-25柱的頂部。3)一旦樣品在頂部樹脂表面下方運行，立即添加PBS(pH7.2-7.4)。4)向所需樣品添加更多PBS(pH7.2-7.4)即可完成柱密封。中國澳門熒光染料luciferin

南京星葉生物科技有限公司是一家有著雄厚實力背景、信譽(yù)可靠、勵精圖治、展望未來、有夢想有目標(biāo)，有組織有體系的公司，堅持于帶領(lǐng)員工在未來的道路上大放光明，攜手共畫藍(lán)圖，在江蘇省等地區(qū)的醫(yī)藥健康行業(yè)中積累了大批忠誠的客戶粉絲源，也收獲了良好的用戶口碑，為公司的發(fā)展奠定的良好的行業(yè)基礎(chǔ)，也希望未來公司能成為*****，努力為行業(yè)領(lǐng)域的發(fā)展奉獻(xiàn)出自己的一份力量，我們相信精益求精的工作態(tài)度和不斷的完善創(chuàng)新理念以及自強(qiáng)不息，斗志昂揚(yáng)的的企業(yè)精神將**南京星葉生物科技供應(yīng)和您一起攜手步入輝煌，共創(chuàng)佳績，一直以來，公司貫徹執(zhí)行科學(xué)管理、創(chuàng)新發(fā)展、誠實守信的方針，員工精誠努力，協(xié)同奮取，以品質(zhì)、服務(wù)來贏得市場，我們一直在路上！