第二種***使用的DNA染色方法是Hoechst染料，**初由化學公司HoechstAG生產(chǎn)。Hoechst33258、Hoechst33342和Hoechst34580都是鄰苯二甲酰亞胺，具有向A-T富集區(qū)插入的趨勢，因此后者不常使用。與DAPI相似，此類染料受到紫外線激發(fā)并在455nm下發(fā)射比較大值，在無結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?10–540nm。Hoechst染料還具有細胞滲透作用，因此可用于固定細胞和活細胞。與DAPI不同是，Hoechst染料毒性更低。DNA染色劑碘化丙啶無法透過細胞膜。在細胞培養(yǎng)中，因為該染色劑無法進入完好的細胞內(nèi)，所以常常被用來區(qū)分活細胞和死細胞。碘化丙啶也是一種結(jié)合劑，但對不同的堿基沒有特異性。在核酸結(jié)合態(tài)下，其比較大激發(fā)波長為538nm，比較高發(fā)射波長為617nm。未結(jié)合狀態(tài)下碘化丙啶的比較大激發(fā)和發(fā)射被移到較短的波長和較弱的強度。它也可以在不改變其熒光特性的情況下與RNA結(jié)合。要區(qū)分DNA和RNA，必須使用足夠的聚合酶。異硫氰酸熒光素(FITC) 是一種有機熒光染料，目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細胞術(shù)中。山東細胞膜熒光染料

CY7是一種CY染料。CY為花菁(Cyanine)的縮寫，是由奇數(shù)個甲基單元連接的兩個氮原子組成的化合物。菁類化合物具有波長長、吸收和發(fā)射可調(diào)、消光系數(shù)高的特點CY系染料常被用于蛋白、抗體以及小分子化合物的標記，對于蛋白抗體的標記，可以通過簡單的混合反應(yīng)來完成結(jié)合，下面我們介紹了蛋白抗體標記的標記方法，具有一定的參考意義。一、比較好蛋白制備1)為獲得標記效果，請制備蛋白(抗體)濃度為2mg/mL。2)蛋白溶液的pH值為8.5±0.5。如果pH值低于8.0，應(yīng)使用1M3)如果蛋白濃度低于2mg/mL，標記效率會**降低。為獲得比較好標記效率，建議**終蛋白濃度范圍為2-10mg/mL。4)蛋白必須在不含伯胺(如Tris或甘氨酸)的緩沖液中，和銨離子，否則會影響標記效率。2.染色制備(以CY3-NHS酯為例)將無水DMSO加入CY3-NHS酯小瓶中，制備成10mM儲備液。通過移液器或渦旋混合均勻計算。使用前需先使用縮合液(500μg/mL)(HY-D0178)活化另一個可進行后續(xù)標記實驗。山東細胞膜熒光染料DiI（橙色熒光），DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）和 DiR （深紅色熒光）對活細胞進行多色成像和流式分析。

D-熒光素是熒光素酶 (Luc) 的天然底物，可催化螢火蟲產(chǎn)生典型的黃綠色光。該反應(yīng)的 560 nm 化學發(fā)光在幾秒鐘內(nèi)達到峰值，當?shù)孜餆晒馑剡^量時，光輸出與熒光素酶濃度成正比。熒光素酶 (luc) 基因是用于研究和藥物篩選的流行報告基因?；瘜W發(fā)光技術(shù)幾乎沒有背景，使得 luc 報告基因成為檢測低水平基因表達的理想選擇。標準閃爍計數(shù)器可以可靠地測量低至 0.02 pg 的熒光素酶。除了作為基因表達報告者的作用外，熒光素酶還常用于極其靈敏的 ATP 檢測中[1]。我們提供螢火蟲熒光素酶 (HY-P1004)、熒光素游離酸 (HY-12591A) 及其水溶性鈉鹽 (HY-12591) 和鉀鹽 (HY-12591B)。

過標記——計算結(jié)果顯示每摩爾145,000MW的蛋白標記的熒光團大于10mol。雖然過標記的蛋白也可以使用，但可能會引起蛋白的聚集、降低抗體結(jié)合抗原的特異性，這些都會造成非特異性結(jié)合。過標記還會引起熒光淬滅?？梢栽黾拥鞍谆驕p少反應(yīng)時間。3．未結(jié)合染料難以去除——盡管大部分時候用分離柱可以較好的純化蛋白偶聯(lián)物，但仍可能會有痕量的游離染料留在偶聯(lián)物溶液中，會使標記計算的值偏高。可用分離柱再次分離或透析去除。4．蛋白或蛋白偶聯(lián)物無法洗脫——不要再加緩沖液，只需再次離心一次或幾次。SUPER Green I核酸染料特點 。

二、***成像分析：D-熒光素，鉀鹽，D-PBS,不含鈣、鎂1、配制溶液使用無菌D-PBS（w/oCa2+;Mg2+）配制D-熒光素鉀鹽溶液（15mg/ml），0.22μm濾膜過濾除菌（避光），分裝后于-20℃或-80℃冷凍保存，避免反復(fù)凍融。使用時4℃融化，實驗前平衡至室溫（避光）2、注射量取決于注射方式，具體如下：注射方式劑量靜脈注射（25-27gauge針頭）按10μl/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15mg/ml熒光素工作液腹腔注射（25-27gauge針頭）按10μl/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15mg/ml熒光素工作液肌肉注射（27gauge針頭）50μl，濃度為1-2mg/ml熒光素工作液鼻內(nèi)注射（pipette）50μl，濃度為3mg/ml熒光素工作液3、注射入體內(nèi)10-20min（待光信號達到**強穩(wěn)定平臺期），再進行成像分析D-熒光素是熒光素酶 (Luc) 的天然底物，可催化螢火蟲產(chǎn)生典型的黃綠色光。廣西細胞膜熒光染料

CY5熒光染料是一種被廣泛應(yīng)用于生物分子檢測和熒光成像等領(lǐng)域的高效、穩(wěn)定的熒光標記試劑。山東細胞膜熒光染料

羰花青染料***用作Di來標記細胞、細胞器、脂質(zhì)體、病毒和脂蛋白。長鏈羰花青包括DiO(DiOC18(3))、DiI(DiIC18(3))、DiD(DiIC18(5))和DiR，以及二烷基氨基苯乙烯基染料DiA(4-Di-16-ASP)用于標記膜和其他疏水結(jié)構(gòu)。DiIC16(3)具有比DiI(C18)更短的烷基取代基(C16)。它們在脂質(zhì)環(huán)境中具有極高的消光系數(shù)、環(huán)境依賴性熒光和短的激發(fā)態(tài)壽命。它們在室溫下是油狀物，在水中發(fā)出微弱熒光，但當摻入膜中或與親脂性生物分子結(jié)合時，它們發(fā)出高熒光且相當耐光。這些光學特性使它們成為細胞質(zhì)膜染色的理想選擇。一旦應(yīng)用于細胞，這些染料就會在質(zhì)膜內(nèi)橫向擴散，導(dǎo)致整個細胞染色[1]。DiO、DiI、DiD和DiR呈現(xiàn)出不同的綠色、橙色、紅色和紅外熒光，從而促進活細胞的多色成像和流式細胞術(shù)分析。DiO和DiI可分別與標準FITC和TRITC過濾器一起使用。其中DiI及其類似物是**常用的，因為它們通常表現(xiàn)出非常低的細胞毒性。此外，DiI***用于測定LDL和HDL等脂蛋白。親脂性氨基苯乙烯基染料DiA也常用于神經(jīng)元示蹤[2]。山東細胞膜熒光染料

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