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寧夏高分子轉(zhuǎn)染試劑

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-05-28

在腺病毒載體或脂質(zhì)體的全身遞送后,轉(zhuǎn)基因表達(dá)相對(duì)短暫。靜脈注射脂叢的肺表達(dá)比給藥后第1天和第2天觀察到的比較大表達(dá)量每周減少約1log。造成這種現(xiàn)象的機(jī)制可能有以下幾種:(a)產(chǎn)生針對(duì)外源基因產(chǎn)物的新***抗體,(b)細(xì)胞因子介導(dǎo)的啟動(dòng)子關(guān)閉,(c)通過凋亡、先天或適應(yīng)性免疫反應(yīng)根除表達(dá)細(xì)胞以及(d)表達(dá)基因的細(xì)胞因細(xì)胞凋亡而減少是導(dǎo)致表達(dá)減少。這些機(jī)制具有重要意義,因?yàn)椴豢赡苤貜?fù)給藥,而且轉(zhuǎn)基因凈表達(dá)會(huì)隨著時(shí)間的推移而減少。盡管通過中和或消除細(xì)胞因子的產(chǎn)生可以提高肺中的基因表達(dá)水平。靜脈給藥引起的毒性可能是由于小鼠轉(zhuǎn)氨酶水平的增加,在相同劑量下,小鼠肝臟出現(xiàn)組織病理學(xué)病變,但肺部沒有不良反應(yīng)。這種增加可以通過使用較少的細(xì)胞毒性陽(yáng)離子脂質(zhì)體(CLs)來(lái)控制。轉(zhuǎn)氨酶的釋放歸因于未甲基化的堿基,如pDNA序列中的胞嘧啶和鳥嘌呤。選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑可能取決于幾個(gè)因素,包括轉(zhuǎn)染核酸的類型和轉(zhuǎn)染的復(fù)雜性(單轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染)。寧夏高分子轉(zhuǎn)染試劑

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在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中使用對(duì)照對(duì)于確定所使用的轉(zhuǎn)染試劑和核酸的效果和效率至關(guān)重要。通常,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和寡核苷酸轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)都需要陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、未轉(zhuǎn)染對(duì)照和模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照是先前已被證明對(duì)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生已知影響的DNA或RNA,例如影響特定下游遺傳靶點(diǎn)的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染工作的初始階段,需要一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照來(lái)建立一個(gè)優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方案,之后,陽(yáng)性對(duì)照可以作為參考,與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較。另一方面,陰性對(duì)照用于確認(rèn)宿主細(xì)胞中預(yù)期的基因表達(dá)變化是否歸因于轉(zhuǎn)染而不是其他原因。在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染中,陰性對(duì)照可以是缺乏DNA和轉(zhuǎn)染載體的反應(yīng),或者兩者都沒有,只有宿主細(xì)胞。在小RNA轉(zhuǎn)染中,陰性對(duì)照包含一個(gè)非同源序列,該序列通常是一個(gè)與靶序列具有相同核苷酸長(zhǎng)度和組成但與任何已知哺乳動(dòng)物基因不同源的打亂序列。未轉(zhuǎn)染的對(duì)照包括不含轉(zhuǎn)染試劑和核酸的細(xì)胞培養(yǎng),作為宿主細(xì)胞基本信息的對(duì)照,包括活力、表型,更重要的是,不受轉(zhuǎn)染影響的靶基因的基線表達(dá)水平。模擬轉(zhuǎn)染是指不含遺傳靶標(biāo)或核酸的轉(zhuǎn)染,可以評(píng)估轉(zhuǎn)染試劑(如背景自熒光噪聲)產(chǎn)生的影響。在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中,推薦使用空質(zhì)粒對(duì)照作為模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。江西shRNA轉(zhuǎn)染試劑一項(xiàng)與抗血管生成基因傳遞高度相關(guān)的發(fā)現(xiàn)是,陽(yáng)離子脂質(zhì)體(CLs)選擇性地靶向的血管系統(tǒng)。

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流式細(xì)胞術(shù)可以更精確地定量表達(dá)特定熒光基因的細(xì)胞,以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。另一種評(píng)估轉(zhuǎn)染效率的方法是通過監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染后的特定蛋白表達(dá)。將轉(zhuǎn)基因引入細(xì)胞可能會(huì)改變由轉(zhuǎn)基因或細(xì)胞中其他基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。同樣,轉(zhuǎn)染小RNA也可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中特定下游遺傳靶點(diǎn)的表達(dá)。免疫印跡和免疫熒光染色可用于評(píng)估轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的變化。在這兩種方法中,使用特異性抗體結(jié)合靶蛋白是至關(guān)重要的,后者需要使用與一抗結(jié)合的熒光標(biāo)記二級(jí)抗體來(lái)檢測(cè)感興趣的蛋白質(zhì)。另一方面,在免疫印跡中,可以使用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗與一抗結(jié)合,進(jìn)行特異性蛋白檢測(cè)。免疫印跡法允許對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行半定量,而免疫熒光染色法允許通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。通過檢查特定蛋白表達(dá)來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率更具可重復(fù)性和直接性。然而,使用抗體所固有的非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合問題和獲得假陰性結(jié)果的可能性,這可能是由于不及時(shí)測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)引起的,仍然是使用這些方法的缺點(diǎn)。

隨著寡核苷酸生物合成產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,不同類型的修飾寡核苷酸也被引入市場(chǎng),以提高小RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染的效率。其中一種是通過化學(xué)修飾來(lái)提高其與靶標(biāo)和阻斷外切酶活性的結(jié)合親和力的agomirs和antagomirs。agomir是一種人工修飾的雙鏈miRNA模擬物,旨在發(fā)揮比傳統(tǒng)miRNA模擬物更高的靶標(biāo)抑制活性(krtzfeldt另一方面,antagomir是一種專門設(shè)計(jì)的單鏈miRNA類似物,旨在抑制特定的miRNA。agomir和antagomir都被認(rèn)為更穩(wěn)定、更有效、更特異,而且與正常的模擬物或拮抗劑相比,對(duì)宿主細(xì)胞膜具有更高的結(jié)合親和力。鎖定核酸(LNA)是另一種修飾的寡核苷酸,其至少一個(gè)核苷酸具有額外的亞甲基橋,以增強(qiáng)其核糖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。其鎖定的核糖結(jié)構(gòu)使得LNA比常用的寡核苷酸更短,從而使其比傳統(tǒng)的寡核苷酸表現(xiàn)出更高的效率、穩(wěn)定性和結(jié)合親和力。NA基寡核苷酸的應(yīng)用已被報(bào)道用于各種生化或功能分析,涉及遞送小RNA分子,如siRNA、miRNA和piRNA。一些基于NA基的轉(zhuǎn)染不需要轉(zhuǎn)染試劑,這可以比較大限度地減少轉(zhuǎn)染過程中試劑的二次效應(yīng)。研究已經(jīng)確定了陽(yáng)離子脂質(zhì)體(CLs)的某些特征,這些特征增強(qiáng)了它們?cè)隗w內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的能力。

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作為一般指導(dǎo)原則,建議使用早期傳代的細(xì)胞以獲得良好的轉(zhuǎn)染效率,特別是涉及原代或干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。另一個(gè)有趣的觀察結(jié)果是,37℃是可以幫助原代細(xì)胞達(dá)到更高轉(zhuǎn)染效率的比較好培養(yǎng)溫度。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)?7攝氏度是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的比較好培養(yǎng)溫度。同時(shí),在轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞時(shí),化學(xué)轉(zhuǎn)染似乎不如病毒和物理轉(zhuǎn)染有吸引力,尤其是在人類原代干細(xì)胞中。當(dāng)在相似條件下使用相同的轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí),細(xì)胞系的來(lái)源(如人類與動(dòng)物細(xì)胞系)也可能有助于不同程度的效率。在一項(xiàng)涉及轉(zhuǎn)染人類和大鼠平滑肌細(xì)胞的研究中,大多數(shù)轉(zhuǎn)染試劑在轉(zhuǎn)染大鼠平滑肌細(xì)胞(α-10SMCs)方面的效率高于轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)。脂質(zhì)顆粒的加入導(dǎo)致內(nèi)體DNA釋放增加。湖南陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑

轉(zhuǎn)染試劑的凍融被認(rèn)為是另一個(gè)可能影響轉(zhuǎn)染效率的潛在因素。寧夏高分子轉(zhuǎn)染試劑

質(zhì)子泵抑制劑可以通過基于從一個(gè)供體蛋白到受體蛋白的能量轉(zhuǎn)移的物理測(cè)量來(lái)評(píng)估,也可以通過化學(xué)測(cè)量來(lái)評(píng)估,在化學(xué)測(cè)量中,表達(dá)的蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)之間的相互作用活性可以在刺激時(shí)通過適當(dāng)?shù)膱?bào)告系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)。后一種基于熒光素酶的方法被稱為生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET),它是熒光共振能量轉(zhuǎn)移研究質(zhì)子泵抑制劑的替代方法。多個(gè)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染也可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)染,其中包括將編碼Cas9蛋白和引導(dǎo)RNA的質(zhì)粒遞送到宿主細(xì)胞,使用CRISPR/Cas9基因組工程系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯。除了使用多個(gè)質(zhì)粒外,雙鏈載體是另一種將不同基因傳遞到宿主細(xì)胞的方法。雙鏈載體是一種能夠表達(dá)兩種不同基因的載體,通過一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)連接,只有一個(gè)啟動(dòng)子。寧夏高分子轉(zhuǎn)染試劑