3.粘壁細胞的染色（1）使粘壁的細胞在無菌實驗室培養(yǎng)。（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。（4）在37℃培養(yǎng)細胞2～20分鐘，不同的細胞比較好培養(yǎng)時間不同。（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細胞，培養(yǎng)5～10分鐘，然后吸干培養(yǎng)基。

4.顯微鏡檢測（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器的選擇參見表1。（2）多色染料的同時檢測，濾光器按照以下設(shè)定：a)DiI和DiO＝OmegaXF52，Chroma51004；b)DiI和DiD＝OmegaXF92，Chroma51007；c)DiI，DiO和DiD＝OmegaXF93，Chroma61005

5.流式細胞儀的檢測DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染色的細胞可以分別用經(jīng)典的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和FL4流式細胞儀檢測。 D-熒光素（D-Luciferin）是螢火熒光素酶底物，其量子效率為0.88，是Luminol的20倍。西安熒光染料脂溶

5(6)-FITC(Fluorescein5(6)-isothiocyanate)是一種胺活性衍生物的熒光染料，具有廣泛的應(yīng)用，作為抗體和其他探針標記，用熒光顯微鏡，流式細胞儀、免疫熒光方法如ELISA和Western印跡實驗。熒光素衍生物具有高吸收率、優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率和良好的水溶性，是流式細胞儀和免疫熒光中生物檢測**常用的熒光標記之一。**常用的熒光素包括用于標記蛋白質(zhì)（特別是抗體）的異硫氰酸熒光素[5(6)-FITC)]，5-FITC和用于標記肽和寡核苷酸的羧基熒光素（5-FAM和5(6)-FAM）。BIOFOUNT提供***的基于熒光素的染料、底物和偶聯(lián)物，以及一系列具有針對細胞標記和檢測優(yōu)化的特性的質(zhì)量iFluor?熒光標記染料。海南北京熒光染料與花青和羅丹明染料一樣，熒光素也是一種有機染料。

琥珀酰亞胺酯（Succinimidylesters）/NHS酯活性熒光染料用于標記抗體，蛋白質(zhì)，肽，胺修飾的寡核苷酸和其他生物分子上的游離氨基（-NH2）2、馬來酰亞胺（Maleimides）活性熒光染料用于標記抗體，蛋白質(zhì)和肽上的巰基3、疊氮化物(Azides)活性熒光染料通過點擊化學法（Click）標記乙烯基4、炔烴(Alkynes)活性熒光染料通過點擊化學方法標記疊氮化物5、羧酸(Carboxylicacids)活性熒光染料經(jīng)碳二亞胺預活化后用于標記胺或用于醇的Steglich酯化6、氨基(Amines)活性熒光染料具有游離氨基的熒光染料，用于與各種親電子化合物（如活化的酯和環(huán)氧化物）偶聯(lián)。

與花青和羅丹明染料一樣，熒光素也是一種有機染料。熒光素的比較大吸收波長為494nm，比較大發(fā)射波長為521nm（通常吸收藍色范圍內(nèi)的光并發(fā)射綠色范圍內(nèi)的光），熒光素是一種高熒光物質(zhì)。即使在非常少量的情況下也可以檢測到它，并且在與抗體結(jié)合時用于顯微鏡檢查。熒光素的衍生物包括異硫氰酸熒光素、俄勒岡綠和羧基萘并熒光素等。與許多其他熒光染料一樣，熒光素價格低廉且易于使用，使其成為生物學研究中很受歡迎的染料之一。與大多數(shù)其他染料不同，熒光素在水溶液中是無毒的。因此，它是極少數(shù)用作地下水示蹤劑的染料之一。動物體內(nèi)光學成像主要采用生物發(fā)光與熒光發(fā)光兩種技術(shù)。

所需的CY3-NHS酯的量取決于待標記蛋白的量，以及CY3-NHS的比較好摩爾比為10。示例：假設(shè)所需的標記蛋白為500μL2mg/mLIgG(MW=150,000)，用100μLDMSO溶解1mgCY3-NHS酯，得到所需的CY3-NHS酯體積為5.05μL，詳細計算過程如下：1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG)=2mg/mL×0.5mL/150，000mg/mmol=6.7×10-6mmol2)mmol(CY3-NHS酯)=mmol(IgG)×10=6.7×10-6mmol×10=6.7×10-5mmol3)uL(CY3-NHS酯)=mmol(CY3-NHS酯)×MW(CY3-NHS酯)/mg/μL(CY3-NHS酯)=6.7×10-5mmol×753.88mg/mmol/0.01mg/μL=5.05μL(CY3-NHS酯)4.運行偶聯(lián)反應(yīng)1)將室溫新鮮制備的10mg/mLCY3-NHS酯緩慢加入到0.5mL蛋白質(zhì)樣品中于溶液中，輕輕搖動混勻，然后短暫離心，將樣品收集于反應(yīng)管底部。請勿混勻，否則2)將反應(yīng)管安置避光處，在接下來的間隔輕輕蛋白水解60分鐘。10-15分鐘，輕輕翻轉(zhuǎn)幾次以充分混合5.偶聯(lián)偶聯(lián)物以下方案是使用SepHadexG-25柱封閉染料-偶聯(lián)偶聯(lián)物的范例。1)根據(jù)制造說明準備SepHadexG-25柱。2)將反應(yīng)混合物(來自“Runconjugationreaction”)加載到SepHadexG-25柱的頂部。3)一旦樣品在頂部樹脂表面下方運行，立即添加PBS(pH7.2-7.4)。4)向所需樣品添加更多PBS(pH7.2-7.4)即可完成柱密封。D-熒光素鉀鹽是熒光素酶的水溶性底物，存在于多種發(fā)光生物體中。甘肅廈門熒光染料

熒光染料可以單獨使用，也可以組合成復合熒光染料使用。西安熒光染料脂溶

羅丹明123一種可對活細胞線粒體染色的細胞染色試劑。羅丹明123可透過細胞膜且在活細胞的線粒體內(nèi)聚集，并發(fā)出黃綠色熒光。羅丹明123***用作檢測線粒體膜電位，也常用于細胞凋亡檢測。由于細胞內(nèi)ATP的量與羅丹明123的熒光強度之間有相關(guān)性，此熒光染料被應(yīng)用于檢測細胞內(nèi)的ATP。羅丹明123的比較大激發(fā)波長為507nm，比較大發(fā)射波長為525nm。在熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光。

一：工作液配制用緩沖液或者預熱的培養(yǎng)液直接稀釋儲存液到需要的工作液濃度（1～20μM），充分混勻。具體的工作液濃度使用者要根據(jù)自身實驗體系進行調(diào)整?！咀⒁狻浚簩τ诩毎麑嶒灒刂坪每傮w稀釋倍數(shù)，DMSO在培養(yǎng)液中的濃度不能超過0.1%，以避免DMSO對細胞的影響。

二：熒光顯微鏡觀察1、用載玻片準備細胞。細胞數(shù)目應(yīng)為5×104～5×105個/mL。2、在載玻片上孵育細胞，用PBS或HBSS洗滌細胞。3、將Rhodamine123工作液加入載玻片并在37℃下孵育30min至1小時。4、去除Rhodamine123溶液并用培養(yǎng)液洗滌細胞（洗滌細胞后如果要固定，加入10%福爾馬林緩沖液并孵育15～20min，接著用PBS洗滌）。5、熒光顯微鏡觀察細胞。 西安熒光染料脂溶