FITC熒光標記蛋白的應(yīng)用及特點:活性熒光染料，如FITC、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、羅丹明B(RhodamineB)或AlexaFluor染料，可用于標記抗體或蛋白質(zhì)功能基團，生成分子探針，并通過熒光成像進行檢測。當用熒光染料化學(xué)標記特異性抗體或其他純化生物分子時，它們成為用于檢測靶抗原或相互作用配偶體的熒光探針，用于細胞成像、流式細胞手術(shù)、蛋白質(zhì)痕跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)。由于熒光標記物具有無放射物污染、操作簡單等優(yōu)點，在蛋白質(zhì)功能研究、藥物篩選等許多研究領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

南京星葉生物科技有限公司Super Fluor 系列（效果同Alexa Fluor系列）

且Super Fluor活化酯（與Invitrogen的Alexa Fluor活化酯完全相同） 與花青和羅丹明染料一樣，熒光素也是一種有機染料。中國香港熒光染料IR780

在1990年代***使用的綠色熒光蛋白（從水母維多利亞水母克?。┘捌溲苌铮ɡ缭寮t藍蛋白、藻膽蛋白和藻紅蛋白等）是當今生物學(xué)研究中**常用的一些生物熒光團。雖然熒光團可用于在細胞、細菌和各種***中表達質(zhì)粒，但它們的使用有一些缺點，即它可能很耗時，并且在融合時還能夠改變某些細胞蛋白的正常生物學(xué)功能。此外，與許多其他熒光團相比，生物熒光團的光穩(wěn)定性和靈敏度較低。綠色熒光蛋白(GFP)綠色熒光蛋白是當下流行的生物熒光團之一，由238個氨基酸組成，其中三個負責(zé)發(fā)出可見綠色熒光的結(jié)構(gòu)。在水母本身中，熒光團與水母發(fā)光蛋白（一種蛋白質(zhì)）相互作用，當添加鈣時會發(fā)出藍光。通過DNA重組，研究人員可以使用負責(zé)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因來研究給定的基因和蛋白質(zhì)。在這里，在將復(fù)合物插入細胞之前，該基因與另一個基因（負責(zé)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的第二個基因）結(jié)合。如果細胞產(chǎn)生綠色熒光，研究人員就可以明顯看出該細胞能夠表達目標基因。GFP由488nm激光線激發(fā)，可在510nm處檢測。來自熒光團的微弱信號可以使用抗GFP抗體放大。作為生物標記物，綠色熒光蛋白用于以下功能：監(jiān)測各種生理過程*識別蛋白質(zhì)定位*檢測轉(zhuǎn)基因表達廣西神經(jīng)熒光染料吲哚菁綠在生物識別和藥物輸送方面也有廣泛的應(yīng)用。

本質(zhì)上，有機染料的特征在于源自在整個生色團上離域的光學(xué)躍遷或源自分子間電荷轉(zhuǎn)移躍遷（從激發(fā)電子態(tài)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移）的發(fā)射。在這里，表現(xiàn)出源自在整個生色團上離域的光學(xué)躍遷的發(fā)射的染料被稱為共振染料（介觀染料），而后者被稱為CT染料（電荷轉(zhuǎn)移染料）?；ㄇ唷⒘_丹明和熒光素是一些最常見的共振染料，其特點是窄的吸收和發(fā)射帶（略微結(jié)構(gòu)化），往往相互鏡像，以及小的、對溶劑極性不敏感的斯托克斯位移。另一方面，CT染料包括香豆素和丹磺酰熒光團等染料，其特點是與共振染料相比，吸收和發(fā)射帶結(jié)構(gòu)無結(jié)構(gòu)，分離良好，以及更大的斯托克斯位移。同樣，與共振染料相比，CT染料具有更小的摩爾吸收系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率。對于共振和CT熒光染料，在結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系眾所周知的情況下，可以通過精心設(shè)計的策略來微調(diào)光譜性質(zhì)。

3.粘壁細胞的染色（1）使粘壁的細胞在無菌實驗室培養(yǎng)。（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。（4）在37℃培養(yǎng)細胞2～20分鐘，不同的細胞比較好培養(yǎng)時間不同。（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細胞，培養(yǎng)5～10分鐘，然后吸干培養(yǎng)基。

4.顯微鏡檢測（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器的選擇參見表1。（2）多色染料的同時檢測，濾光器按照以下設(shè)定：a)DiI和DiO＝OmegaXF52，Chroma51004；b)DiI和DiD＝OmegaXF92，Chroma51007；c)DiI，DiO和DiD＝OmegaXF93，Chroma61005

5.流式細胞儀的檢測DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染色的細胞可以分別用經(jīng)典的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和FL4流式細胞儀檢測。 非磺化花青類染料- 該組中的一些染料包括 cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7 和 cy7.5。

Hoechst33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低。用于細胞核染色時，推薦的Hoechst33258工作濃度為0.5-10μg/ml。儲存條件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。注意事項：Hoechst33258對人體有害，請注意適當防護。熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當天完成檢測。為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液?？篃晒獯銣绶馄?P0126)可以向碧云天訂購。為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作注意事項：Hoechst33342對人體有一定刺激性，請注意適當防護。熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當天完成檢測。為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液。為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染料是一族親脂性的熒光染料，可以用來染細胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。中國香港熒光染料高分子

Super Fluor 750（效果同Alexa Fluor 750）熒光染料。中國香港熒光染料IR780

三、流式細胞儀分析1、取對數(shù)生長期的細胞，接種到孔板，過夜培養(yǎng)。2、如果要進行藥物刺激，在細胞中加入感興趣的藥物進行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，收集細胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重懸細胞，37℃避光孵育15min或更長時間。【注意】：由于細胞種類和實驗體系不同，Rhodamine123工作液濃度和孵育時間可以根據(jù)預(yù)實驗或參考文獻自行調(diào)整。4、用流式細胞儀檢測。

四、實驗案例1、取對數(shù)生長期A549細胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基）,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁，以便后續(xù)實驗操作.2、棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次.3、用培養(yǎng)基（無血清）稀釋Rh123母液制備1～20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細胞類型和細胞濃度。4、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細胞去除背景色.6、熒光顯微鏡觀察. 中國香港熒光染料IR780