FITC熒光標記蛋白的應用及特點:活性熒光染料，如FITC、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、羅丹明B(RhodamineB)或AlexaFluor染料，可用于標記抗體或蛋白質功能基團，生成分子探針，并通過熒光成像進行檢測。當用熒光染料化學標記特異性抗體或其他純化生物分子時，它們成為用于檢測靶抗原或相互作用配偶體的熒光探針，用于細胞成像、流式細胞手術、蛋白質痕跡和酶聯免疫吸附實驗(ELISA)。由于熒光標記物具有無放射物污染、操作簡單等優(yōu)點，在蛋白質功能研究、藥物篩選等許多研究領域得到了越來越廣泛的應用。

南京星葉生物科技有限公司Super Fluor 系列（效果同Alexa Fluor系列）

且Super Fluor活化酯（與Invitrogen的Alexa Fluor活化酯完全相同） 與花青和羅丹明染料一樣，熒光素也是一種有機染料。中國香港熒光染料IR780

在1990年代***使用的綠色熒光蛋白（從水母維多利亞水母克?。┘捌溲苌铮ɡ缭寮t藍蛋白、藻膽蛋白和藻紅蛋白等）是當今生物學研究中**常用的一些生物熒光團。雖然熒光團可用于在細胞、細菌和各種***中表達質粒，但它們的使用有一些缺點，即它可能很耗時，并且在融合時還能夠改變某些細胞蛋白的正常生物學功能。此外，與許多其他熒光團相比，生物熒光團的光穩(wěn)定性和靈敏度較低。綠色熒光蛋白(GFP)綠色熒光蛋白是當下流行的生物熒光團之一，由238個氨基酸組成，其中三個負責發(fā)出可見綠色熒光的結構。在水母本身中，熒光團與水母發(fā)光蛋白（一種蛋白質）相互作用，當添加鈣時會發(fā)出藍光。通過DNA重組，研究人員可以使用負責產生蛋白質的基因來研究給定的基因和蛋白質。在這里，在將復合物插入細胞之前，該基因與另一個基因（負責產生所需蛋白質的第二個基因）結合。如果細胞產生綠色熒光，研究人員就可以明顯看出該細胞能夠表達目標基因。GFP由488nm激光線激發(fā)，可在510nm處檢測。來自熒光團的微弱信號可以使用抗GFP抗體放大。作為生物標記物，綠色熒光蛋白用于以下功能：監(jiān)測各種生理過程*識別蛋白質定位*檢測轉基因表達廣西神經熒光染料吲哚菁綠在生物識別和藥物輸送方面也有廣泛的應用。

本質上，有機染料的特征在于源自在整個生色團上離域的光學躍遷或源自分子間電荷轉移躍遷（從激發(fā)電子態(tài)的分子內電荷轉移）的發(fā)射。在這里，表現出源自在整個生色團上離域的光學躍遷的發(fā)射的染料被稱為共振染料（介觀染料），而后者被稱為CT染料（電荷轉移染料）?；ㄇ唷⒘_丹明和熒光素是一些最常見的共振染料，其特點是窄的吸收和發(fā)射帶（略微結構化），往往相互鏡像，以及小的、對溶劑極性不敏感的斯托克斯位移。另一方面，CT染料包括香豆素和丹磺酰熒光團等染料，其特點是與共振染料相比，吸收和發(fā)射帶結構無結構，分離良好，以及更大的斯托克斯位移。同樣，與共振染料相比，CT染料具有更小的摩爾吸收系數和熒光量子產率。對于共振和CT熒光染料，在結構-性質關系眾所周知的情況下，可以通過精心設計的策略來微調光譜性質。

3.粘壁細胞的染色（1）使粘壁的細胞在無菌實驗室培養(yǎng)。（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。（4）在37℃培養(yǎng)細胞2～20分鐘，不同的細胞比較好培養(yǎng)時間不同。（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細胞，培養(yǎng)5～10分鐘，然后吸干培養(yǎng)基。

4.顯微鏡檢測（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器的選擇參見表1。（2）多色染料的同時檢測，濾光器按照以下設定：a)DiI和DiO＝OmegaXF52，Chroma51004；b)DiI和DiD＝OmegaXF92，Chroma51007；c)DiI，DiO和DiD＝OmegaXF93，Chroma61005

5.流式細胞儀的檢測DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染色的細胞可以分別用經典的FL1，FL2，FL3和FL4流式細胞儀檢測。 非磺化花青類染料- 該組中的一些染料包括 cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7 和 cy7.5。

Hoechst33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低。用于細胞核染色時，推薦的Hoechst33258工作濃度為0.5-10μg/ml。儲存條件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。注意事項：Hoechst33258對人體有害，請注意適當防護。熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當天完成檢測。為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液?？篃晒獯銣绶馄?P0126)可以向碧云天訂購。為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作注意事項：Hoechst33342對人體有一定刺激性，請注意適當防護。熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當天完成檢測。為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液。為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染料是一族親脂性的熒光染料，可以用來染細胞膜和其它脂溶性生物結構。中國香港熒光染料高分子

Super Fluor 750（效果同Alexa Fluor 750）熒光染料。中國香港熒光染料IR780

三、流式細胞儀分析1、取對數生長期的細胞，接種到孔板，過夜培養(yǎng)。2、如果要進行藥物刺激，在細胞中加入感興趣的藥物進行干預，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，收集細胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重懸細胞，37℃避光孵育15min或更長時間。【注意】：由于細胞種類和實驗體系不同，Rhodamine123工作液濃度和孵育時間可以根據預實驗或參考文獻自行調整。4、用流式細胞儀檢測。

四、實驗案例1、取對數生長期A549細胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基）,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁，以便后續(xù)實驗操作.2、棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次.3、用培養(yǎng)基（無血清）稀釋Rh123母液制備1～20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細胞類型和細胞濃度。4、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細胞去除背景色.6、熒光顯微鏡觀察. 中國香港熒光染料IR780