三：貼壁細(xì)胞染色1、將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于無菌蓋玻片上。2、從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，但要使表面保持濕潤。3、在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動(dòng)使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。4、37℃孵育細(xì)胞2~20min，不同的細(xì)胞比較好培養(yǎng)時(shí)間不同?？梢?0min作為起始孵育時(shí)間，之后優(yōu)化體系以得到均一的標(biāo)記效果。5、吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2~3次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞，孵育5~10min，然后吸干培養(yǎng)基。但要使表面保持濕潤。四：結(jié)果檢測樣品可在培養(yǎng)基中進(jìn)行檢測，可通過熒光顯微鏡成像或流式細(xì)胞儀分析。非磺化花青類染料- 該組中的一些染料包括 cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7 和 cy7.5。山西細(xì)胞熒光染料

Hoechst33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低。用于細(xì)胞核染色時(shí)，推薦的Hoechst33258工作濃度為0.5-10μg/ml。儲(chǔ)存條件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。注意事項(xiàng)：Hoechst33258對人體有害，請注意適當(dāng)防護(hù)。熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測。為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液?？篃晒獯銣绶馄?P0126)可以向碧云天訂購。為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作注意事項(xiàng)：Hoechst33342對人體有一定刺激性，請注意適當(dāng)防護(hù)。熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測。為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液。為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。山西細(xì)胞熒光染料D-熒光素（D-Luciferin）是螢火熒光素酶底物，其量子效率為0.88，是Luminol的20倍。

三、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)D-熒光素鉀鹽體外生物發(fā)光試驗(yàn)：D-熒光素鉀鹽，無菌純水，完全培養(yǎng)基（自行配制）1、貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中孵育數(shù)小時(shí)或過夜，使細(xì)胞貼壁。懸浮細(xì)胞：可以將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板后直接進(jìn)行后續(xù)操作，無需孵育。如果倍增時(shí)間相對較短，則應(yīng)考慮倍增時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。2、將15mg熒光素鉀鹽溶解于1ml無菌水中，制備成100X熒光素儲(chǔ)備液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動(dòng)至熒光素鉀鹽完全溶解?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。3、用預(yù)熱好的細(xì)胞培養(yǎng)基1∶100稀釋100X熒光素儲(chǔ)備液（15mg/ml），配制成熒光素工作液（終濃度150μg/ml），即配即用。4、去除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基。5、在成像前，將適量熒光素工作液加入細(xì)胞中，然后進(jìn)行圖像分析。注意：成像前在37℃下對細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間孵育可增強(qiáng)信號。孵育時(shí)間取決于特定的細(xì)胞類型。一般來說孵育10分鐘就足夠了，根據(jù)需要進(jìn)行測試和調(diào)整。6、每隔10分鐘，**多40分鐘，使用VILBERFUSIONFX成像系統(tǒng)檢查體外生物發(fā)光，確定動(dòng)力學(xué)曲線并找出細(xì)胞的峰值成像時(shí)間點(diǎn)

1.DiD，DiO，DiI，DiR和DiS細(xì)胞膜染色液制備（1）配置DMSO或EtOH儲(chǔ)存液：儲(chǔ)存液用DMSO或EtOH配置濃度1～5mM。注意：未使用的儲(chǔ)存液保存在-20°C，避免反復(fù)凍融。（2）工作液制備：用合適的緩沖液（如：無血清培養(yǎng)基，HBSS或PBS）稀釋儲(chǔ)存液，配制濃度為1～5μM的工作液。注意：工作液的**終濃度是根據(jù)不同細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)來配制?？梢詮耐扑]濃度的十倍以上尋找比較好條件。

2.懸浮細(xì)胞染色（1）懸浮細(xì)胞密度為1×106/mL加入到工作液中。（2）在37℃培養(yǎng)細(xì)胞2～20分鐘，不同的細(xì)胞比較好培養(yǎng)時(shí)間不同。（3）染色細(xì)胞試管在1000～1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。（4）傾倒上清液，再次緩慢加入預(yù)溫37℃的培養(yǎng)液。（5）重復(fù)（3），（4）步驟兩次以上。 D-熒光素鉀鹽小動(dòng)物成像。

常用抗體標(biāo)記熒光染料的特性及其應(yīng)用

1、FITC:激發(fā)波長488nm，比較大發(fā)射波長525nm。1)其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氟離子激光器的流式細(xì)胞儀;2)在流式細(xì)胞儀的FL1通道檢測;3)可用于熒光顯微鏡技術(shù)4)熒光強(qiáng)度易受PH值影響，PH值降低時(shí)其熒光強(qiáng)度減弱。2、AlexaFluor488:激發(fā)波長488nm，比較大發(fā)射波長519nm。1)其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氟離子激光器的流式細(xì)胞儀:2)在流式細(xì)胞儀的FL1通道檢測;3)具有超乎尋常的光穩(wěn)定性，非常適用于熒光顯微鏡技術(shù);4)在較寬的PH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定(PH4~10)。5)南京星葉生物科技有限公司SuperFluor系列（效果同AlexaFluor系列）質(zhì)優(yōu)價(jià)廉，歡迎咨詢。3、Cy3:激發(fā)波長488nm，比較大發(fā)射波長570nm。1)其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氟離子激光器的流式細(xì)胞儀;2)在流式細(xì)胞儀的FL2通道檢測:3)適用于熒光顯微鏡技術(shù);4)為小分子染料，非常適合需小分子染料的流式細(xì)胞術(shù)，熒光強(qiáng)度低于PE。 目前常用標(biāo)記蛋白/抗體的熒光素主要有BODIPY類、香豆素類、羅丹明類、近紅外類、NBD胺類以及菁染料等。中國澳門熒光染料綠色

5(6)-FITC (Fluorescein 5(6)-isothiocyanate) 是一種胺活性衍生物的熒光染料.山西細(xì)胞熒光染料

InvitrogenCy3染料是一種明亮的橙色熒光染料，可使用532nm激光線激發(fā)，并使用TRITC（四甲基羅丹明）濾光片組進(jìn)行可視化。除了免疫細(xì)胞化學(xué)應(yīng)用，Cy3染料通常用于標(biāo)記核酸。發(fā)光說明：Cy3熒光團(tuán)也是親脂性神經(jīng)元和長期DiI細(xì)胞追蹤試劑的基礎(chǔ)，該試劑添加烷基尾(≥12個(gè)碳）添加到**熒光團(tuán)上。Cy3染料是用于成像、流式細(xì)胞術(shù)和基因組應(yīng)用的蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合物的傳統(tǒng)橙色熒光標(biāo)簽。它也是經(jīng)典親脂性示蹤劑DiI及其變體的基礎(chǔ)。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，Cy3可分為普通Cy3（常簡稱Cy3）和磺化Cy3（Sulfo-Cy3）。Cy3水溶性較低，在水相標(biāo)記反應(yīng)時(shí)常常需要使用有機(jī)共溶劑，常用有機(jī)溶劑包括DMF，DMSO和乙腈等?；腔疌y3是在Cy3的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上磺化的產(chǎn)物，附帶2個(gè)或3個(gè)磺酸根離子。由于磺化效應(yīng)，磺化Cy3的亮度比Cy3稍亮，熒光穩(wěn)定性也提高，可賴受更長時(shí)間的曝光?；腔疌y3水溶性極高，所以在標(biāo)記反應(yīng)中不需要使用有機(jī)共溶劑，特別適合標(biāo)記蛋白等對有機(jī)溶劑敏感的生物分子。另外磺化Cy3水溶性極好，并且染料分子本身帶電荷，標(biāo)記到蛋白表面后不會(huì)引發(fā)疏水性蛋白聚集，提高熒光標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。當(dāng)然，磺化Cy3-NHS也可溶于甲醇，DMSO，DMF等有機(jī)溶劑，標(biāo)記反應(yīng)也可以在純有機(jī)溶劑中進(jìn)行。山西細(xì)胞熒光染料