一、體外生物發(fā)光試驗(yàn)熒光素試劑的制備：D-熒光素，鉀鹽，無菌純水，完全培養(yǎng)基（自行配置）1、用無菌水制備100X熒光素原液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動(dòng)至熒光素完全溶解。混勻后立即使用或分裝后-20℃凍存。2、將D-luciferin，potassiumsalt溶解于預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基中制備成濃度為150μg/ml的工作液。用組織培養(yǎng)基1∶100稀釋儲(chǔ)存液，配置工作液(終濃度150μg/mL)3、去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基圖像分析前，向細(xì)胞培養(yǎng)板中添加1×熒光素工作液，然后進(jìn)行圖像分析-注射器濾膜過濾除菌，0.2μm注：成像前在37℃下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行短時(shí)間孵育可增強(qiáng)信號(hào)。熒光染料可以單獨(dú)使用，也可以組合成復(fù)合熒光染料使用。納米熒光染料藍(lán)色

三、流式細(xì)胞儀分析1、取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，接種到孔板，過夜培養(yǎng)。2、如果要進(jìn)行藥物刺激，在細(xì)胞中加入感興趣的藥物進(jìn)行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重懸細(xì)胞，37℃避光孵育15min或更長時(shí)間?！咀⒁狻浚河捎诩?xì)胞種類和實(shí)驗(yàn)體系不同，Rhodamine123工作液濃度和孵育時(shí)間可以根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)或參考文獻(xiàn)自行調(diào)整。4、用流式細(xì)胞儀檢測。

四、實(shí)驗(yàn)案例1、取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基）,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作.2、棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次.3、用培養(yǎng)基（無血清）稀釋Rh123母液制備1～20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。4、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細(xì)胞去除背景色.6、熒光顯微鏡觀察. 納米熒光染料藍(lán)色Super Fluor 680（效果同Alexa Fluor 680）琥珀酰亞胺酯熒光染料。

除了以上應(yīng)用，吲哚菁綠還可以用于生物識(shí)別和藥物輸送。在生物識(shí)別中，吲哚菁綠可以與特定的生物分子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)這些分子的檢測和定量分析。這項(xiàng)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中有著廣泛的應(yīng)用前景。此外，吲哚菁綠還可以作為藥物輸送系統(tǒng)的一部分，將藥物包裹在其分子結(jié)構(gòu)中，通過近紅外光***釋放藥物，實(shí)現(xiàn)靶向***。吲哚菁綠作為一種多功能的熒光染料，在醫(yī)學(xué)和生物領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。其綠色溶解度的優(yōu)良性能，使其能夠在水溶液中快速溶解，為其在醫(yī)學(xué)影像學(xué)、光熱***、生物識(shí)別和藥物輸送等方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信吲哚菁綠在未來將發(fā)揮更大的潛力，為人類健康事業(yè)做出更大的貢獻(xiàn)。吲哚菁綠作為一種熒光染料，在醫(yī)學(xué)影像學(xué)中的應(yīng)用是**為突出的。它可以通過靜脈注射進(jìn)入人體血液循環(huán)系統(tǒng)，并在近紅外激光的照射下發(fā)出熒光信號(hào)。這種熒光信號(hào)可以被**的顯像設(shè)備捕獲和記錄，從而形成高分辨率、高對(duì)比度的影像。這樣的影像可以幫助醫(yī)生觀察和分析血管、淋巴系統(tǒng)以及**等病變的情況，提供重要的診斷依據(jù)。

藻紅蛋白-藻紅蛋白(PE)是一種紅色蛋白色素復(fù)合物，屬于藻膽蛋白家族。它可以在紅藻和隱植物中找到，它作為葉綠素色素的附屬物。在生物科學(xué)中，熒光團(tuán)可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，例如用于抗原檢測的抗體等，因?yàn)樗軌虬l(fā)出明亮的熒光。由于熒光團(tuán)往往會(huì)很快發(fā)生光漂白，因此很少在熒光顯微鏡中使用。它經(jīng)常用于流式細(xì)胞術(shù)。※別藻藍(lán)蛋白(APC)-與藻紅蛋白一樣，別藻藍(lán)蛋白也屬于藻膽蛋白家族，是從紅藻中分離出來的。在594和633nm的激光線激發(fā)下，熒光團(tuán)的比較大吸光度在650nm處，而熒光發(fā)射峰在66nm處。與熒光素偶聯(lián)物相比，熒光團(tuán)的靈敏度已顯示高5至10倍，并具有許多其他有益特性，包括大斯托克斯位移、高水溶性、長波長發(fā)射和耐猝滅。雖然別藻藍(lán)蛋白通常不用于需要光穩(wěn)定性的應(yīng)用，但它***用于流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、微陣列等過程以及各種依賴高靈敏度的應(yīng)用。DiD，DiO，DiI，DiR和DiS 染色的細(xì)胞可以分別用經(jīng)典的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和FL4流式細(xì)胞儀檢測。

熒光染料:能發(fā)出熒光的染料。在吸收紫外線或可見光后，能把短波長的光轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄩL較長的可見光波而反射出來，呈閃亮的鮮艷色彩。例如，酸性曙紅、熒光黃、紅汞以及某些分散染料等。它們大多是含有苯環(huán)或雜環(huán)并帶有共軛雙鍵的化合物。熒光染料可以單獨(dú)使用，也可以組合成復(fù)合熒光染料使用。其中復(fù)合熒光染料是利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)合成的熒光染料，由距離非常近、能量可以在彼此間傳遞的一個(gè)供體及一個(gè)受體熒光物分子所組成。復(fù)合染料在受體分子的激發(fā)波長被激發(fā)，在供體分子的發(fā)射波長發(fā)射一個(gè)光子。熒光染料發(fā)展非常迅速，已開發(fā)的用于科研和臨床應(yīng)用的熒光染料已基本覆蓋了由紫外到可見光及紅外的整個(gè)光譜范圍。熒光素的衍生物包括異硫氰酸熒光素、俄勒岡綠和羧基萘并熒光素等。納米熒光染料藍(lán)色

與花青和羅丹明染料一樣，熒光素也是一種有機(jī)染料。納米熒光染料藍(lán)色

第二種***使用的DNA染色方法是Hoechst染料，**初由化學(xué)公司HoechstAG生產(chǎn)。Hoechst33258、Hoechst33342和Hoechst34580都是鄰苯二甲酰亞胺，具有向A-T富集區(qū)插入的趨勢，因此后者不常使用。與DAPI相似，此類染料受到紫外線激發(fā)并在455nm下發(fā)射比較大值，在無結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?10–540nm。Hoechst染料還具有細(xì)胞滲透作用，因此可用于固定細(xì)胞和活細(xì)胞。與DAPI不同是，Hoechst染料毒性更低。DNA染色劑碘化丙啶無法透過細(xì)胞膜。在細(xì)胞培養(yǎng)中，因?yàn)樵撊旧珓o法進(jìn)入完好的細(xì)胞內(nèi)，所以常常被用來區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。碘化丙啶也是一種結(jié)合劑，但對(duì)不同的堿基沒有特異性。在核酸結(jié)合態(tài)下，其比較大激發(fā)波長為538nm，比較高發(fā)射波長為617nm。未結(jié)合狀態(tài)下碘化丙啶的比較大激發(fā)和發(fā)射被移到較短的波長和較弱的強(qiáng)度。它也可以在不改變其熒光特性的情況下與RNA結(jié)合。要區(qū)分DNA和RNA，必須使用足夠的聚合酶。納米熒光染料藍(lán)色