3.粘壁細(xì)胞的染色（1）使粘壁的細(xì)胞在無菌實驗室培養(yǎng)。（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。（4）在37℃培養(yǎng)細(xì)胞2～20分鐘，不同的細(xì)胞比較好培養(yǎng)時間不同。（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞，培養(yǎng)5～10分鐘，然后吸干培養(yǎng)基。

4.顯微鏡檢測（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器的選擇參見表1。（2）多色染料的同時檢測，濾光器按照以下設(shè)定：a)DiI和DiO＝OmegaXF52，Chroma51004；b)DiI和DiD＝OmegaXF92，Chroma51007；c)DiI，DiO和DiD＝OmegaXF93，Chroma61005

5.流式細(xì)胞儀的檢測DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染色的細(xì)胞可以分別用經(jīng)典的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和FL4流式細(xì)胞儀檢測。 小動物成像熒光染料是一種先進(jìn)的技術(shù)可以在小動物體內(nèi)實時觀察和研究細(xì)胞、組織的功能和代謝過程。江蘇供應(yīng)熒光染料

CY5熒光染料是一種被廣泛應(yīng)用于生物分子檢測和熒光成像等領(lǐng)域的高效、穩(wěn)定的熒光標(biāo)記試劑。它具有出色的熒光性能和良好的生物相容性。Cy5屬于小分子染料，其*大發(fā)射波長為670nm，其標(biāo)記的抗體適用于所有配備633nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀，檢測通道一般是FL4通道。除流式細(xì)胞術(shù)外，Cy5同樣適用于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術(shù)。需注意的是，Cy5與單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的非特異性結(jié)合多，實驗結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性。Cy5.5含有一個游離胺基,可與多種官能團(tuán)共軛,包括NHS酯和環(huán)氧化合物。激發(fā)和發(fā)射的最大值分別為678nm和694nm。Cy5.5已應(yīng)用于各種基于熒光的實驗中。Cy5.5是一種遠(yuǎn)紅色(和近紅外)發(fā)射染料,是熒光測量的理想選擇。Cy5.5具有成本效益,且其標(biāo)記化學(xué)操作簡單,適合于潛在的***藥物開發(fā)Cy5.5標(biāo)記因子VIIa是用來想象**的。用這些靶向蛋白標(biāo)記的Cy5.5在**異種移植物上特異定位至少14天,但未結(jié)合的Cy5.5不能定位于任何異種移植或***。這種**血管內(nèi)皮細(xì)胞中抗組織因子的成像方法可用于檢測原發(fā)性**和轉(zhuǎn)移以及監(jiān)測體內(nèi)***反應(yīng)[1]。pH/溫度敏感磁性納米凝膠結(jié)合Cy5.5標(biāo)記乳鐵蛋白(Cy5.5-Lf-MPNA納米凝膠)是一種有前途的膠質(zhì)瘤術(shù)前MRI和術(shù)中熒光成像的對比劑[2]湖北大連熒光染料脂溶性熒光染料cy3、cy5、cy7等。

熒光染料:能發(fā)出熒光的染料。在吸收紫外線或可見光后，能把短波長的光轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄩL較長的可見光波而反射出來，呈閃亮的鮮艷色彩。例如，酸性曙紅、熒光黃、紅汞以及某些分散染料等。它們大多是含有苯環(huán)或雜環(huán)并帶有共軛雙鍵的化合物。熒光染料可以單獨(dú)使用，也可以組合成復(fù)合熒光染料使用。其中復(fù)合熒光染料是利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)合成的熒光染料，由距離非常近、能量可以在彼此間傳遞的一個供體及一個受體熒光物分子所組成。復(fù)合染料在受體分子的激發(fā)波長被激發(fā)，在供體分子的發(fā)射波長發(fā)射一個光子。熒光染料發(fā)展非常迅速，已開發(fā)的用于科研和臨床應(yīng)用的熒光染料已基本覆蓋了由紫外到可見光及紅外的整個光譜范圍。

SuperFluor活化酯（與Invitrogen的AlexaFluor活化酯完全相同）SuperFlour系列熒光探針，具有更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，更廣的pH應(yīng)用范圍（pH4～10）,更好的抗淬滅性。在生物熒光領(lǐng)域已逐漸替代FITC,Cy3,Cy5,Cy5.5,Cy7等熒光染料。1．標(biāo)記效率低——計算結(jié)果顯示每摩爾145,000MW的蛋白標(biāo)記的熒光團(tuán)少于4mol有以下原因：1）緩沖液中含有痕量伯銨成分，與染料反應(yīng)降低了標(biāo)記效率。如果蛋白已經(jīng)溶于含氨基的緩沖液（如Tris或氨基乙酸），標(biāo)記前用PBS透析。2）蛋白含量較低(≤1mg/mL)會影響標(biāo)記效率。3）標(biāo)記步驟中加入碳酸氫鈉的作用是將反應(yīng)混合物的pH升高至～8，因為在弱堿性環(huán)境中標(biāo)記反應(yīng)的效率比較高。如果蛋白溶液的緩沖范圍在低pH，加入重碳酸鹽也無法將pH調(diào)節(jié)至**適水平。要么加大重碳酸鹽的量，要么將緩沖液換成PBS，或用0.1M碳酸氫鈉透析等。4）研究顯示pH升至9.0～9.4，標(biāo)記效率和標(biāo)記速度（只需10min）明顯改善。5）不同抗體與熒光團(tuán)的反應(yīng)速率不同，染料標(biāo)記后保留的生物活性程度也不同，因此標(biāo)準(zhǔn)步驟也不是總有比較好的標(biāo)記結(jié)果。為增加標(biāo)記率，可以對同一樣品進(jìn)行再標(biāo)記，或減少蛋白的量加大染料的量重新標(biāo)記。有研究者在室溫孵育1小時后再4℃孵育過夜，情況有所改善。Super Flour 系列熒光探針，具有更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，更廣的pH應(yīng)用范圍（pH 4～10）, 更好的抗淬滅性。

所需的CY3-NHS酯的量取決于待標(biāo)記蛋白的量，以及CY3-NHS的比較好摩爾比為10。示例：假設(shè)所需的標(biāo)記蛋白為500μL2mg/mLIgG(MW=150,000)，用100μLDMSO溶解1mgCY3-NHS酯，得到所需的CY3-NHS酯體積為5.05μL，詳細(xì)計算過程如下：1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG)=2mg/mL×0.5mL/150，000mg/mmol=6.7×10-6mmol2)mmol(CY3-NHS酯)=mmol(IgG)×10=6.7×10-6mmol×10=6.7×10-5mmol3)uL(CY3-NHS酯)=mmol(CY3-NHS酯)×MW(CY3-NHS酯)/mg/μL(CY3-NHS酯)=6.7×10-5mmol×753.88mg/mmol/0.01mg/μL=5.05μL(CY3-NHS酯)4.運(yùn)行偶聯(lián)反應(yīng)1)將室溫新鮮制備的10mg/mLCY3-NHS酯緩慢加入到0.5mL蛋白質(zhì)樣品中于溶液中，輕輕搖動混勻，然后短暫離心，將樣品收集于反應(yīng)管底部。請勿混勻，否則2)將反應(yīng)管安置避光處，在接下來的間隔輕輕蛋白水解60分鐘。10-15分鐘，輕輕翻轉(zhuǎn)幾次以充分混合5.偶聯(lián)偶聯(lián)物以下方案是使用SepHadexG-25柱封閉染料-偶聯(lián)偶聯(lián)物的范例。1)根據(jù)制造說明準(zhǔn)備SepHadexG-25柱。2)將反應(yīng)混合物(來自“Runconjugationreaction”)加載到SepHadexG-25柱的頂部。3)一旦樣品在頂部樹脂表面下方運(yùn)行，立即添加PBS(pH7.2-7.4)。4)向所需樣品添加更多PBS(pH7.2-7.4)即可完成柱密封。南京星葉生物熒光染料標(biāo)記蛋白。湖北大連熒光染料

Cy7 DiC18（DiR）是一個親脂性、近紅外熒光花青染料，這個染料常用于標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)膜。江蘇供應(yīng)熒光染料

三：貼壁細(xì)胞染色1、將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于無菌蓋玻片上。2、從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，但要使表面保持濕潤。3、在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。4、37℃孵育細(xì)胞2~20min，不同的細(xì)胞比較好培養(yǎng)時間不同?？梢?0min作為起始孵育時間，之后優(yōu)化體系以得到均一的標(biāo)記效果。5、吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2~3次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞，孵育5~10min，然后吸干培養(yǎng)基。但要使表面保持濕潤。四：結(jié)果檢測樣品可在培養(yǎng)基中進(jìn)行檢測，可通過熒光顯微鏡成像或流式細(xì)胞儀分析。江蘇供應(yīng)熒光染料