過標記——計算結(jié)果顯示每摩爾145,000MW的蛋白標記的熒光團大于10mol。雖然過標記的蛋白也可以使用，但可能會引起蛋白的聚集、降低抗體結(jié)合抗原的特異性，這些都會造成非特異性結(jié)合。過標記還會引起熒光淬滅?？梢栽黾拥鞍谆驕p少反應(yīng)時間。3．未結(jié)合染料難以去除——盡管大部分時候用分離柱可以較好的純化蛋白偶聯(lián)物，但仍可能會有痕量的游離染料留在偶聯(lián)物溶液中，會使標記計算的值偏高。可用分離柱再次分離或透析去除。4．蛋白或蛋白偶聯(lián)物無法洗脫——不要再加緩沖液，只需再次離心一次或幾次。DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常見的細胞膜染料，它們是一族親脂性的熒光染料，用于細胞的形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)研究。免疫組化熒光染料Fluor 750

二、***成像分析：D-熒光素，鉀鹽，D-PBS,不含鈣、鎂1、配制溶液使用無菌D-PBS（w/oCa2+;Mg2+）配制D-熒光素鉀鹽溶液（15mg/ml），0.22μm濾膜過濾除菌（避光），分裝后于-20℃或-80℃冷凍保存，避免反復(fù)凍融。使用時4℃融化，實驗前平衡至室溫（避光）2、注射量取決于注射方式，具體如下：注射方式劑量靜脈注射（25-27gauge針頭）按10μl/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15mg/ml熒光素工作液腹腔注射（25-27gauge針頭）按10μl/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的15mg/ml熒光素工作液肌肉注射（27gauge針頭）50μl，濃度為1-2mg/ml熒光素工作液鼻內(nèi)注射（pipette）50μl，濃度為3mg/ml熒光素工作液3、注射入體內(nèi)10-20min（待光信號達到**強穩(wěn)定平臺期），再進行成像分析細胞膜熒光染料納米Super Fluor 750（效果同Alexa Fluor 750）熒光染料。

小動物***成像技術(shù)（invivoimagingtechnology）是利用高靈敏度的光學(xué)檢測儀器直接檢測動物***體內(nèi)的細胞活動和基因行為研究的一類技術(shù)，是近年來發(fā)展**快的生命科學(xué)研究方法，是**直接觀察細胞和分子在體內(nèi)行為的新興技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域[1]。***動物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光與熒光發(fā)光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是利用熒光素酶報告基因在***內(nèi)表達產(chǎn)生的熒光蛋白與體外注射的熒光素底物發(fā)生化學(xué)反映產(chǎn)生熒光。而熒光發(fā)光成像技術(shù)是將熒光物質(zhì)或熒光物質(zhì)標記的小分子物質(zhì)如基因、細胞也可是小分子藥物、抗體、納米材料等導(dǎo)入到***體內(nèi)，通過小動物***成像系統(tǒng)的激發(fā)光源激發(fā)熒光集團到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生波長較激發(fā)光長的發(fā)射光，然后通過高靈敏度制冷CCD鏡頭探測到***內(nèi)的發(fā)射光。通過***成像技術(shù)可以觀測***動物體內(nèi)**的生長和轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生、特定基因的表達和藥物作用效果等生物學(xué)過程。

細胞培養(yǎng)后，需要對其生長情況、形態(tài)甚至生物學(xué)性狀進行觀察。由于細胞小而復(fù)雜，若不借助適當(dāng)?shù)氖侄?，難以觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)，更難發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細胞的技術(shù)，從光學(xué)顯微鏡到電子顯微鏡，從一般細胞化學(xué)法到免疫化學(xué)法。細胞染色是研究細胞生物學(xué)特征的一種常用手段，然而，對于細胞實驗新手來說，想要獲得一張漂亮的細胞染色圖并不容易。染色試劑不會選、細胞染色不均勻、染色時切片脫落等都是很常見的問題。

細胞膜常用染料DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常見的細胞膜染料（見表2），它們是一族親脂性的熒光染料，用于細胞的形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)研究。該系列染料進入細胞膜后，會在整個細胞膜上側(cè)向擴散，在比較好濃度時可以使整個細胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高，染色均一，熒光不易猝滅，無明顯細胞毒性，且受自身熒光背景干擾小。目前DiD已成功應(yīng)用于多種細胞的體內(nèi)示蹤研究，如Treg細胞、間充質(zhì)干細胞、腫瘤細胞、造血干祖細胞等。 SUPER Green I核酸染料特點 。

5(6)-FITC(Fluorescein5(6)-isothiocyanate)是一種胺活性衍生物的熒光染料，具有廣泛的應(yīng)用，作為抗體和其他探針標記，用熒光顯微鏡，流式細胞儀、免疫熒光方法如ELISA和Western印跡實驗。熒光素衍生物具有高吸收率、優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率和良好的水溶性，是流式細胞儀和免疫熒光中生物檢測**常用的熒光標記之一。**常用的熒光素包括用于標記蛋白質(zhì)（特別是抗體）的異硫氰酸熒光素[5(6)-FITC)]，5-FITC和用于標記肽和寡核苷酸的羧基熒光素（5-FAM和5(6)-FAM）。BIOFOUNT提供***的基于熒光素的染料、底物和偶聯(lián)物，以及一系列具有針對細胞標記和檢測優(yōu)化的特性的質(zhì)量iFluor?熒光標記染料。目前常用標記蛋白/抗體的熒光素主要有BODIPY類、香豆素類、羅丹明類、近紅外類、NBD胺類以及菁染料等。免疫組化熒光染料Fluor 750

南京星葉生物熒光染料標記蛋白。免疫組化熒光染料Fluor 750

納米粒子納米顆粒是指尺寸在1到100納米之間的顆粒。由于它們的小尺寸，納米粒子通常用于不同類型的細胞和組織的熒光成像。當(dāng)今生物成像中常用的一些納米材料包括碳點、貴金屬納米顆粒、聚合物點、量子點和熒光摻雜二氧化硅等。在成像中，與其他分子熒光團和探針相比，納米顆粒/納米材料具有多種優(yōu)勢，使其成為理想的選擇。除了提高亮度外，納米粒子是惰性的并且往往分布均勻，這有助于在成像過程中獲得更好的結(jié)果。此外，與各種分子熒光團相比，納米顆粒和納米材料沒有細胞毒性，并且不受非特異性結(jié)合問題的影響。由于這些特性，大多數(shù)熒光納米顆粒（染色納米顆粒）可以內(nèi)化到細胞/組織中，并容易靶向給定部位。免疫組化熒光染料Fluor 750