納米粒子納米顆粒是指尺寸在1到100納米之間的顆粒。由于它們的小尺寸，納米粒子通常用于不同類型的細(xì)胞和組織的熒光成像。當(dāng)今生物成像中常用的一些納米材料包括碳點(diǎn)、貴金屬納米顆粒、聚合物點(diǎn)、量子點(diǎn)和熒光摻雜二氧化硅等。在成像中，與其他分子熒光團(tuán)和探針相比，納米顆粒/納米材料具有多種優(yōu)勢，使其成為理想的選擇。除了提高亮度外，納米粒子是惰性的并且往往分布均勻，這有助于在成像過程中獲得更好的結(jié)果。此外，與各種分子熒光團(tuán)相比，納米顆粒和納米材料沒有細(xì)胞毒性，并且不受非特異性結(jié)合問題的影響。由于這些特性，大多數(shù)熒光納米顆粒（染色納米顆粒）可以內(nèi)化到細(xì)胞/組織中，并容易靶向給定部位。目前常用標(biāo)記蛋白/抗體的熒光素主要有BODIPY類、香豆素類、羅丹明類、近紅外類、NBD胺類以及菁染料等。外泌體熒光染料發(fā)射

Cy7DiC18（DiR）是一個親脂性、近紅外熒光花青染料。這個染料常用于標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)膜。Cy7DiC18（DiR）的兩個18-碳鏈插入到細(xì)胞膜，從而進(jìn)行特定的、穩(wěn)定的細(xì)胞染色，幾乎不會發(fā)生細(xì)胞間的染料轉(zhuǎn)移。Cy7DiC18（DiR）（近紅外熒光）和其他細(xì)胞膜熒光染料如DiI（橙色熒光），DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）配合使用，為多色成像和流式細(xì)胞分析提供了有效的工具。Cy7DiC18（DiR）染色后可進(jìn)行多聚甲醛（不可使用甲醇等其他試劑）的固定，但不建議在染色后進(jìn)行透化的過程。此外，在固定透化（室溫下用0.1%TritonX-100透化）后，也可以很好地進(jìn)行質(zhì)膜染色。

1、Cy7DiC18（DiR）染色固定的細(xì)胞或組織樣品時，通常使用配制在PBS中的4%多聚甲醛進(jìn)行固定，使用其它不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簳?dǎo)致熒光背景較高。

2、為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 熒光素鉀鹽熒光染料Alexa fluor異硫氰酸熒光素(FITC) 是一種有機(jī)熒光染料，目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中。

第二種***使用的DNA染色方法是Hoechst染料，**初由化學(xué)公司HoechstAG生產(chǎn)。Hoechst33258、Hoechst33342和Hoechst34580都是鄰苯二甲酰亞胺，具有向A-T富集區(qū)插入的趨勢，因此后者不常使用。與DAPI相似，此類染料受到紫外線激發(fā)并在455nm下發(fā)射比較大值，在無結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?10–540nm。Hoechst染料還具有細(xì)胞滲透作用，因此可用于固定細(xì)胞和活細(xì)胞。與DAPI不同是，Hoechst染料毒性更低。DNA染色劑碘化丙啶無法透過細(xì)胞膜。在細(xì)胞培養(yǎng)中，因?yàn)樵撊旧珓o法進(jìn)入完好的細(xì)胞內(nèi)，所以常常被用來區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。碘化丙啶也是一種結(jié)合劑，但對不同的堿基沒有特異性。在核酸結(jié)合態(tài)下，其比較大激發(fā)波長為538nm，比較高發(fā)射波長為617nm。未結(jié)合狀態(tài)下碘化丙啶的比較大激發(fā)和發(fā)射被移到較短的波長和較弱的強(qiáng)度。它也可以在不改變其熒光特性的情況下與RNA結(jié)合。要區(qū)分DNA和RNA，必須使用足夠的聚合酶。

一、體外生物發(fā)光試驗(yàn)熒光素試劑的制備：D-熒光素，鉀鹽，無菌純水，完全培養(yǎng)基（自行配置）1、用無菌水制備100X熒光素原液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動至熒光素完全溶解。混勻后立即使用或分裝后-20℃凍存。2、將D-luciferin，potassiumsalt溶解于預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基中制備成濃度為150μg/ml的工作液。用組織培養(yǎng)基1∶100稀釋儲存液，配置工作液(終濃度150μg/mL)3、去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基圖像分析前，向細(xì)胞培養(yǎng)板中添加1×熒光素工作液，然后進(jìn)行圖像分析-注射器濾膜過濾除菌，0.2μm注：成像前在37℃下對細(xì)胞進(jìn)行短時間孵育可增強(qiáng)信號。南京星葉生物熒光染料標(biāo)記蛋白。

在1990年代***使用的綠色熒光蛋白（從水母維多利亞水母克?。┘捌溲苌铮ɡ缭寮t藍(lán)蛋白、藻膽蛋白和藻紅蛋白等）是當(dāng)今生物學(xué)研究中**常用的一些生物熒光團(tuán)。雖然熒光團(tuán)可用于在細(xì)胞、細(xì)菌和各種***中表達(dá)質(zhì)粒，但它們的使用有一些缺點(diǎn)，即它可能很耗時，并且在融合時還能夠改變某些細(xì)胞蛋白的正常生物學(xué)功能。此外，與許多其他熒光團(tuán)相比，生物熒光團(tuán)的光穩(wěn)定性和靈敏度較低。綠色熒光蛋白(GFP)綠色熒光蛋白是當(dāng)下流行的生物熒光團(tuán)之一，由238個氨基酸組成，其中三個負(fù)責(zé)發(fā)出可見綠色熒光的結(jié)構(gòu)。在水母本身中，熒光團(tuán)與水母發(fā)光蛋白（一種蛋白質(zhì)）相互作用，當(dāng)添加鈣時會發(fā)出藍(lán)光。通過DNA重組，研究人員可以使用負(fù)責(zé)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因來研究給定的基因和蛋白質(zhì)。在這里，在將復(fù)合物插入細(xì)胞之前，該基因與另一個基因（負(fù)責(zé)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的第二個基因）結(jié)合。如果細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光，研究人員就可以明顯看出該細(xì)胞能夠表達(dá)目標(biāo)基因。GFP由488nm激光線激發(fā)，可在510nm處檢測。來自熒光團(tuán)的微弱信號可以使用抗GFP抗體放大。作為生物標(biāo)記物，綠色熒光蛋白用于以下功能：監(jiān)測各種生理過程*識別蛋白質(zhì)定位*檢測轉(zhuǎn)基因表達(dá)非磺化花青類染料- 該組中的一些染料包括 cy3、cy3.3、cy5、cy5.5、cy7 和 cy7.5。熒光素鉀鹽熒光染料Alexa fluor

Super Flour 系列在生物熒光領(lǐng)域已逐漸替代FITC,Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7等熒光染料。外泌體熒光染料發(fā)射

其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)常用染料生物染料在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組分鑒定中有著廣泛的應(yīng)用，除細(xì)胞膜研究外，我們經(jīng)常也會對一些其它細(xì)胞結(jié)構(gòu)及成分進(jìn)行探索，例如線粒體、溶酶體、蛋白質(zhì)、細(xì)胞核等，而對于不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有不同的染料進(jìn)行染色細(xì)胞染色神器DAPI+PhalloidinDAPI染色液（DAPIStainingSolution）常用于細(xì)胞核染色，可將細(xì)胞核染成藍(lán)色。鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是細(xì)胞骨架的染色神器，羅丹明標(biāo)記的Phalloidin（TRITC-Phalloidin）可將細(xì)胞染成橙紅色，DAPI與Phalloidin染色液是研究細(xì)胞形態(tài)變化時經(jīng)常用到的兩種共染的試劑，染色效果可見A1-E1用TRITC-鬼筆環(huán)肽（橙紅）染色的細(xì)胞骨架免疫熒光圖；A2-E2用DAPI（藍(lán)色）染色的細(xì)胞核免疫熒光圖；A3-E3合并的L929細(xì)胞免疫熒光染色圖。是S100A16過表達(dá)或下調(diào)前后PDAC細(xì)胞形態(tài)的變化。外泌體熒光染料發(fā)射