熒光染料標記蛋白或肽技術是一種常見的蛋白質體外標記技術。除了GFP等熒光蛋白的融合表達外，目標蛋白還可以通過熒光染料標記直接進行下游實驗操作，如***跟蹤、細胞分選等。

FITC熒光標記的原理是什么？

熒光標記所依賴的化合物稱為熒光材料。熒光材料是指具有共軛雙鍵系統(tǒng)化學結構的化合物。當受到紫外線或藍紫光的照射時，它可以被刺激為刺激狀態(tài)。當激發(fā)狀態(tài)恢復到基本狀態(tài)時，它會發(fā)出熒光。蛋白質熒光標記技術利用熒光材料的共價結合在目標分子的基團上，利用其熒光特性提供研究對象的信息。 CY7 是一種 CY 染料。CY 為花菁 (Cyanine) 的縮寫，是由奇數(shù)個甲基單元連接的兩個氮原子組成的化合物。山東免疫熒光熒光染料

三、細胞實驗D-熒光素鉀鹽體外生物發(fā)光試驗：D-熒光素鉀鹽，無菌純水，完全培養(yǎng)基（自行配制）1、貼壁細胞：將細胞接種于培養(yǎng)板中孵育數(shù)小時或過夜，使細胞貼壁。懸浮細胞：可以將細胞接種于培養(yǎng)板后直接進行后續(xù)操作，無需孵育。如果倍增時間相對較短，則應考慮倍增時間進行細胞計數(shù)。2、將15mg熒光素鉀鹽溶解于1ml無菌水中，制備成100X熒光素儲備液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動至熒光素鉀鹽完全溶解?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。3、用預熱好的細胞培養(yǎng)基1∶100稀釋100X熒光素儲備液（15mg/ml），配制成熒光素工作液（終濃度150μg/ml），即配即用。4、去除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基。5、在成像前，將適量熒光素工作液加入細胞中，然后進行圖像分析。注意：成像前在37℃下對細胞進行短時間孵育可增強信號。孵育時間取決于特定的細胞類型。一般來說孵育10分鐘就足夠了，根據(jù)需要進行測試和調整。6、每隔10分鐘，**多40分鐘，使用VILBERFUSIONFX成像系統(tǒng)檢查體外生物發(fā)光，確定動力學曲線并找出細胞的峰值成像時間點山東免疫熒光熒光染料南京星葉生物提供多種性價比高的各類活化熒光素，例如Cy系列、Super Fluor 系列（效果同Alexa Fluor系列）等。

琥珀酰亞胺酯（Succinimidylesters）/NHS酯活性熒光染料用于標記抗體，蛋白質，肽，胺修飾的寡核苷酸和其他生物分子上的游離氨基（-NH2）2、馬來酰亞胺（Maleimides）活性熒光染料用于標記抗體，蛋白質和肽上的巰基3、疊氮化物(Azides)活性熒光染料通過點擊化學法（Click）標記乙烯基4、炔烴(Alkynes)活性熒光染料通過點擊化學方法標記疊氮化物5、羧酸(Carboxylicacids)活性熒光染料經碳二亞胺預活化后用于標記胺或用于醇的Steglich酯化6、氨基(Amines)活性熒光染料具有游離氨基的熒光染料，用于與各種親電子化合物（如活化的酯和環(huán)氧化物）偶聯(lián)。

蛋白熒光標記技術是目前**為常見的蛋白體外標記技術，利用級聯(lián)放大反應原理，將極度敏感性且易于檢測的熒光素通過某個基團吸附或共價結合后，標記到特異性抗原或抗體分子上，應用熒光顯微鏡觀察熒光標記物因增強放大效應而產生顏色、光譜等變化，以分析示蹤相應抗體或抗原性質與含量的方法。該技術在具有高度精確性的熒光顯微鏡下，借助高度靈敏性的熒光檢測，在各種生物過程中對目的蛋白進行可視化，從而通過抗原抗體高度特異性免疫定量表達或在細胞研究中定位。蛋白熒光標記已成為研究蛋白質互作、酶活性、***示蹤以及細胞分選重要工具。蛋白標記常用熒光染料隨著蛋白熒光標記技術不斷發(fā)展，各類熒光素廣泛應用于生物實驗中，目前常用標記蛋白/抗體的熒光素主要有BODIPY類、香豆素類、羅丹明類、近紅外類、NBD胺類以及菁染料等。南京星葉生物科技有限公司提供多種性價比高的各類活化熒光素，其熒光染料覆蓋波長范圍從350nm到790nm，例如Cy系列、SuperFluor系列（效果同AlexaFluor系列）等，用于標記抗體、多肽以及蛋白功能基團，繼而生成分子探針，通過熒光成像進行相應檢測。Super Fluor 680（效果同Alexa Fluor 680）琥珀酰亞胺酯熒光染料。

SuperFluor活化酯（與Invitrogen的AlexaFluor活化酯完全相同）SuperFlour系列熒光探針，具有更強的熒光強度，更廣的pH應用范圍（pH4～10）,更好的抗淬滅性。在生物熒光領域已逐漸替代FITC,Cy3,Cy5,Cy5.5,Cy7等熒光染料。1．標記效率低——計算結果顯示每摩爾145,000MW的蛋白標記的熒光團少于4mol有以下原因：1）緩沖液中含有痕量伯銨成分，與染料反應降低了標記效率。如果蛋白已經溶于含氨基的緩沖液（如Tris或氨基乙酸），標記前用PBS透析。2）蛋白含量較低(≤1mg/mL)會影響標記效率。3）標記步驟中加入碳酸氫鈉的作用是將反應混合物的pH升高至～8，因為在弱堿性環(huán)境中標記反應的效率比較高。如果蛋白溶液的緩沖范圍在低pH，加入重碳酸鹽也無法將pH調節(jié)至**適水平。要么加大重碳酸鹽的量，要么將緩沖液換成PBS，或用0.1M碳酸氫鈉透析等。4）研究顯示pH升至9.0～9.4，標記效率和標記速度（只需10min）明顯改善。5）不同抗體與熒光團的反應速率不同，染料標記后保留的生物活性程度也不同，因此標準步驟也不是總有比較好的標記結果。為增加標記率，可以對同一樣品進行再標記，或減少蛋白的量加大染料的量重新標記。有研究者在室溫孵育1小時后再4℃孵育過夜，情況有所改善。D-熒光素鉀鹽是熒光素酶的水溶性底物，存在于多種發(fā)光生物體中。外泌體熒光染料紅色

D-熒光素（D-Luciferin）是螢火熒光素酶底物，其量子效率為0.88，是Luminol的20倍。山東免疫熒光熒光染料

在1990年代***使用的綠色熒光蛋白（從水母維多利亞水母克隆）及其衍生物（例如藻紅藍蛋白、藻膽蛋白和藻紅蛋白等）是當今生物學研究中**常用的一些生物熒光團。雖然熒光團可用于在細胞、細菌和各種***中表達質粒，但它們的使用有一些缺點，即它可能很耗時，并且在融合時還能夠改變某些細胞蛋白的正常生物學功能。此外，與許多其他熒光團相比，生物熒光團的光穩(wěn)定性和靈敏度較低。綠色熒光蛋白(GFP)綠色熒光蛋白是當下流行的生物熒光團之一，由238個氨基酸組成，其中三個負責發(fā)出可見綠色熒光的結構。在水母本身中，熒光團與水母發(fā)光蛋白（一種蛋白質）相互作用，當添加鈣時會發(fā)出藍光。通過DNA重組，研究人員可以使用負責產生蛋白質的基因來研究給定的基因和蛋白質。在這里，在將復合物插入細胞之前，該基因與另一個基因（負責產生所需蛋白質的第二個基因）結合。如果細胞產生綠色熒光，研究人員就可以明顯看出該細胞能夠表達目標基因。GFP由488nm激光線激發(fā)，可在510nm處檢測。來自熒光團的微弱信號可以使用抗GFP抗體放大。作為生物標記物，綠色熒光蛋白用于以下功能：監(jiān)測各種生理過程*識別蛋白質定位*檢測轉基因表達山東免疫熒光熒光染料