小動(dòng)物***熒光成像技術(shù)是現(xiàn)***物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)，因其具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)直觀、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開(kāi)發(fā)等方面。納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，旨在解決傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)面臨的各種醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)，包括生物利用度差，靶向特異性受損，全身和***毒性等。納米材料具有很多與眾不同的優(yōu)點(diǎn)，比如多功能性、大的負(fù)載量、靶向性、血液循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)等。納米材料在生物醫(yī)學(xué)中起著關(guān)鍵作用，可以有效攜帶成像探針、***劑或生物材料并傳遞至靶點(diǎn)，如特定的***、組織甚至細(xì)胞。光學(xué)成像主要包括生物發(fā)光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇ，ＢＬＩ）和焚光成像（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇ，Ｆ１）兩種技術(shù)。前者利用焚光素酶基因（如ＦＬＵＣ，ＲＬＵＣ，ＧＬＵＣ）標(biāo)記細(xì)胞或ＤＮＡ，其表達(dá)產(chǎn)物與莖火蟲(chóng)素類底物反應(yīng)產(chǎn)生熒光。后者包括多種熒光蛋白基因（如ＧＦＰ，ＲＦＰ，ＹＦＰ等）、有機(jī)熒光染料、熒光上轉(zhuǎn)換納米粒子、量子點(diǎn)等的應(yīng)用。 Super Fluor 555（效果同Alexa Fluor 555）琥珀酰亞胺酯熒光染料。成都熒光染料IR780

1.DiD，DiO，DiI，DiR和DiS細(xì)胞膜染色液制備（1）配置DMSO或EtOH儲(chǔ)存液：儲(chǔ)存液用DMSO或EtOH配置濃度1～5mM。注意：未使用的儲(chǔ)存液保存在-20°C，避免反復(fù)凍融。（2）工作液制備：用合適的緩沖液（如：無(wú)血清培養(yǎng)基，HBSS或PBS）稀釋儲(chǔ)存液，配制濃度為1～5μM的工作液。注意：工作液的**終濃度是根據(jù)不同細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)來(lái)配制。可以從推薦濃度的十倍以上尋找比較好條件。

2.懸浮細(xì)胞染色（1）懸浮細(xì)胞密度為1×106/mL加入到工作液中。（2）在37℃培養(yǎng)細(xì)胞2～20分鐘，不同的細(xì)胞比較好培養(yǎng)時(shí)間不同。（3）染色細(xì)胞試管在1000～1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。（4）傾倒上清液，再次緩慢加入預(yù)溫37℃的培養(yǎng)液。（5）重復(fù)（3），（4）步驟兩次以上。 湖南成都熒光染料南京星葉生物熒光染料標(biāo)記蛋白。

常用抗體標(biāo)記熒光染料的特性及其應(yīng)用

1、FITC:激發(fā)波長(zhǎng)488nm，比較大發(fā)射波長(zhǎng)525nm。1)其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氟離子激光器的流式細(xì)胞儀;2)在流式細(xì)胞儀的FL1通道檢測(cè);3)可用于熒光顯微鏡技術(shù)4)熒光強(qiáng)度易受PH值影響，PH值降低時(shí)其熒光強(qiáng)度減弱。2、AlexaFluor488:激發(fā)波長(zhǎng)488nm，比較大發(fā)射波長(zhǎng)519nm。1)其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氟離子激光器的流式細(xì)胞儀:2)在流式細(xì)胞儀的FL1通道檢測(cè);3)具有超乎尋常的光穩(wěn)定性，非常適用于熒光顯微鏡技術(shù);4)在較寬的PH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定(PH4~10)。5)南京星葉生物科技有限公司SuperFluor系列（效果同AlexaFluor系列）質(zhì)優(yōu)價(jià)廉，歡迎咨詢。3、Cy3:激發(fā)波長(zhǎng)488nm，比較大發(fā)射波長(zhǎng)570nm。1)其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氟離子激光器的流式細(xì)胞儀;2)在流式細(xì)胞儀的FL2通道檢測(cè):3)適用于熒光顯微鏡技術(shù);4)為小分子染料，非常適合需小分子染料的流式細(xì)胞術(shù)，熒光強(qiáng)度低于PE。

熒光染料:能發(fā)出熒光的染料。在吸收紫外線或可見(jiàn)光后，能把短波長(zhǎng)的光轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄩL(zhǎng)較長(zhǎng)的可見(jiàn)光波而反射出來(lái)，呈閃亮的鮮艷色彩。例如，酸性曙紅、熒光黃、紅汞以及某些分散染料等。它們大多是含有苯環(huán)或雜環(huán)并帶有共軛雙鍵的化合物。熒光染料可以單獨(dú)使用，也可以組合成復(fù)合熒光染料使用。其中復(fù)合熒光染料是利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)合成的熒光染料，由距離非常近、能量可以在彼此間傳遞的一個(gè)供體及一個(gè)受體熒光物分子所組成。復(fù)合染料在受體分子的激發(fā)波長(zhǎng)被激發(fā)，在供體分子的發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射一個(gè)光子。熒光染料發(fā)展非常迅速，已開(kāi)發(fā)的用于科研和臨床應(yīng)用的熒光染料已基本覆蓋了由紫外到可見(jiàn)光及紅外的整個(gè)光譜范圍。DAPI染色液（DAPI Staining Solution）常用于細(xì)胞核染色，可將細(xì)胞核染成藍(lán)色。

注：建議對(duì)每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，從而確定比較高信號(hào)檢測(cè)時(shí)間和信號(hào)平臺(tái)期。保存和操作的過(guò)程中都要避光。另外水溶性儲(chǔ)存液過(guò)濾除菌后，可以-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復(fù)凍融。如果有條件，對(duì)儲(chǔ)存液充氮?dú)饣驓鍤猓ǚ乐寡趸?，穩(wěn)定性和保存時(shí)間更長(zhǎng)。 注射方式，動(dòng)物類型以及體重等都會(huì)影響信號(hào)的發(fā)射，因此建議每次實(shí)驗(yàn)都要做熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，確定比較好信號(hào)平臺(tái)期和比較好的檢測(cè)時(shí)間。熒光素鉀鹽和熒光素鈉鹽應(yīng)用上沒(méi)有差別，兩者的差別在于物理性狀上如外形和溶解性。鈉鹽的水溶性高于鉀鹽。從目前發(fā)表的文獻(xiàn)來(lái)看，鉀鹽的使用率遠(yuǎn)高于鈉鹽，尤其是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。兩者功效相同。 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。南京星葉生物科技有限公司Super Fluor系列（效果同Alexa Fluor 系列）。遼寧北京熒光染料

FITC熒光染料標(biāo)記方法。成都熒光染料IR780

3.粘壁細(xì)胞的染色（1）使粘壁的細(xì)胞在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過(guò)量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動(dòng)使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。（4）在37℃培養(yǎng)細(xì)胞2～20分鐘，不同的細(xì)胞比較好培養(yǎng)時(shí)間不同。（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞，培養(yǎng)5～10分鐘，然后吸干培養(yǎng)基。

4.顯微鏡檢測(cè)（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器的選擇參見(jiàn)表1。（2）多色染料的同時(shí)檢測(cè)，濾光器按照以下設(shè)定：a)DiI和DiO＝OmegaXF52，Chroma51004；b)DiI和DiD＝OmegaXF92，Chroma51007；c)DiI，DiO和DiD＝OmegaXF93，Chroma61005

5.流式細(xì)胞儀的檢測(cè)DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染色的細(xì)胞可以分別用經(jīng)典的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和FL4流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 成都熒光染料IR780