細(xì)胞培養(yǎng)后,需要對其生長情況、形態(tài)甚至生物學(xué)性狀進(jìn)行觀察。由于細(xì)胞小而復(fù)雜,若不借助適當(dāng)?shù)氖侄?,難以觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu),更難發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)各種組分的分子組成及功能。目前,已有多種研究細(xì)胞的技術(shù),從光學(xué)顯微鏡到電子顯微鏡,從一般細(xì)胞化學(xué)法到免疫化學(xué)法。細(xì)胞染色是研究細(xì)胞生物學(xué)特征的一種常用手段,然而,對于細(xì)胞實驗新手來說,想要獲得一張漂亮的細(xì)胞染色圖并不容易。染色試劑不會選、細(xì)胞染色不均勻、染色時切片脫落等都是很常見的問題。
細(xì)胞膜常用染料DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常見的細(xì)胞膜染料(見表2),它們是一族親脂性的熒光染料,用于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和結(jié)構(gòu)研究。該系列染料進(jìn)入細(xì)胞膜后,會在整個細(xì)胞膜上側(cè)向擴(kuò)散,在比較好濃度時可以使整個細(xì)胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高,染色均一,熒光不易猝滅,無明顯細(xì)胞毒性,且受自身熒光背景干擾小。目前DiD已成功應(yīng)用于多種細(xì)胞的體內(nèi)示蹤研究,如Treg細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、造血干祖細(xì)胞等。 熒光染料,由于靈敏度高,操作方便,逐漸取代了放射性同位素作為檢測標(biāo)記,其應(yīng)用于熒光探針,細(xì)胞染色等。大連熒光染料DIR
選擇熒光染料時要考慮那些因素:激發(fā)波長處的消光系數(shù)應(yīng)盡可能高:消光系數(shù)是衡量可以吸收多少光子的量度。量子產(chǎn)率應(yīng)該盡可能高:這是吸收光子與發(fā)射光子的比率。消光系數(shù)和量子產(chǎn)率的乘積就是亮度。熒光染料應(yīng)該是光穩(wěn)定的:遺憾的是,比較不同公司染料的光穩(wěn)定性的研究并不多。光致變色行為:對于STORM實驗,您需要一個閃爍的熒光團(tuán)。但是,對于分子跟蹤實驗,您***不想要閃爍的熒光團(tuán)?;?死細(xì)胞滲透性。您想要的反應(yīng)側(cè)基(例如HaloTag、抗體等)。當(dāng)您使用多個熒光探針時,尤其是當(dāng)您量化共定位時,請謹(jǐn)慎處理其他顏色通道中的滲色。單獨測試所有熒光探針以評估滲透。新疆化合物熒光染料吲哚菁綠(Indocyanine Green,簡稱ICG)是一種廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物領(lǐng)域的熒光染料。
染料DiI, DiO, DiD 和 DiR是一類親脂性熒光染料家族,用于標(biāo)記細(xì)胞膜和疏水性組織。這是一類環(huán)境敏感型熒光染料,當(dāng)它們與膜結(jié)合或者與親脂性生物分子(例如蛋白質(zhì),雖然在水中其熒光強度很弱)結(jié)合時,其熒光強度***增強。它們具有很高的淬滅系數(shù),偏光依賴性和很短的激發(fā)壽命。一旦應(yīng)用于細(xì)胞中,這種染料會在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜中逐步擴(kuò)散,導(dǎo)致在其比較好濃度條件下,將整個細(xì)胞染色。它們不同的熒光顏色:DiI(橙色熒光)、DiO(綠色熒光)、DiD(紅色熒光)、DiR(深紅色熒光),為活細(xì)胞多色彩熒光成像分析和流式細(xì)胞術(shù)提供了一種便捷的工具。DiO和DiI可以分別與標(biāo)準(zhǔn)的FITC和TRITC濾光器一同使用。其中,DiO可以被633 nm He-Ne激光激發(fā),并且具有比DiI更長的激發(fā)和發(fā)射光波長,為標(biāo)記細(xì)胞和組織的那些本身就具有本底熒光的染料提供了非常***的替代品。DiR在***成像或者示蹤中非常有用,因為它們所發(fā)射的紅外光可以高效地穿過細(xì)胞和組織,并且在紅外光范圍內(nèi),其本底熒光水平很低。
FITC熒光標(biāo)記蛋白的應(yīng)用及特點:活性熒光染料,如FITC、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、羅丹明B(RhodamineB)或AlexaFluor染料,可用于標(biāo)記抗體或蛋白質(zhì)功能基團(tuán),生成分子探針,并通過熒光成像進(jìn)行檢測。當(dāng)用熒光染料化學(xué)標(biāo)記特異性抗體或其他純化生物分子時,它們成為用于檢測靶抗原或相互作用配偶體的熒光探針,用于細(xì)胞成像、流式細(xì)胞手術(shù)、蛋白質(zhì)痕跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)。由于熒光標(biāo)記物具有無放射物污染、操作簡單等優(yōu)點,在蛋白質(zhì)功能研究、藥物篩選等許多研究領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。
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且Super Fluor活化酯(與Invitrogen的Alexa Fluor活化酯完全相同) Cy5.5含有一個游離胺基,可與多種官能團(tuán)共軛,包括NHS酯和環(huán)氧化合物。
三、流式細(xì)胞儀分析1、取對數(shù)生長期的細(xì)胞,接種到孔板,過夜培養(yǎng)。2、如果要進(jìn)行藥物刺激,在細(xì)胞中加入感興趣的藥物進(jìn)行干預(yù),繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后,收集細(xì)胞,PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重懸細(xì)胞,37℃避光孵育15min或更長時間?!咀⒁狻浚河捎诩?xì)胞種類和實驗體系不同,Rhodamine123工作液濃度和孵育時間可以根據(jù)預(yù)實驗或參考文獻(xiàn)自行調(diào)整。4、用流式細(xì)胞儀檢測。
四、實驗案例1、取對數(shù)生長期A549細(xì)胞接于六孔板(1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基),37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁,以便后續(xù)實驗操作.2、棄掉培養(yǎng)液,PBS洗滌兩次.3、用培養(yǎng)基(無血清)稀釋Rh123母液制備1~20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。4、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細(xì)胞去除背景色.6、熒光顯微鏡觀察. Cy3染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別在550 nm和570 nm左右。廣西熒光染料IR780
南京星葉生物熒光染料標(biāo)記蛋白。大連熒光染料DIR
熒光染料,由于靈敏度高,操作方便,逐漸取代了放射性同位素作為檢測標(biāo)記,其廣泛應(yīng)用于熒光免疫,熒光探針,細(xì)胞染色等。包括特異性的DNA染色,用于染色體分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等相關(guān)研究。另有很多核酸染料在多色染色系統(tǒng)中是非常有用的復(fù)染劑,可作為背景對照,標(biāo)記細(xì)胞核使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系一目了然。熒光標(biāo)記的單克隆抗體技術(shù)為流式細(xì)胞儀在研究細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)各種功能性抗原、**基因蛋白等領(lǐng)域擴(kuò)展了無限的應(yīng)用空間。熒光探針可以通過蛋白質(zhì)交聯(lián)劑共價結(jié)合在單克隆抗體上。免疫熒光標(biāo)記**常用的染料有異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、藻紅蛋白(PE)以及AlexaFluor系列染料等。核酸熒光染料對細(xì)胞核染色后定量測量細(xì)胞所發(fā)出的熒光強度,就可以確定細(xì)胞核中DNA、RNA的含量,并可以對細(xì)胞周期和細(xì)胞的增殖狀況進(jìn)行分析。有多種熒光染料可以對細(xì)胞中的DNA或RNA染色,常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst33342等,RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。大連熒光染料DIR