細胞培養(yǎng)后，需要對其生長情況、形態(tài)甚至生物學性狀進行觀察。由于細胞小而復雜，若不借助適當?shù)氖侄?，難以觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)，更難發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細胞的技術(shù)，從光學顯微鏡到電子顯微鏡，從一般細胞化學法到免疫化學法。細胞染色是研究細胞生物學特征的一種常用手段，然而，對于細胞實驗新手來說，想要獲得一張漂亮的細胞染色圖并不容易。染色試劑不會選、細胞染色不均勻、染色時切片脫落等都是很常見的問題。

細胞膜常用染料DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常見的細胞膜染料（見表2），它們是一族親脂性的熒光染料，用于細胞的形態(tài)學和結(jié)構(gòu)研究。該系列染料進入細胞膜后，會在整個細胞膜上側(cè)向擴散，在比較好濃度時可以使整個細胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高，染色均一，熒光不易猝滅，無明顯細胞毒性，且受自身熒光背景干擾小。目前DiD已成功應用于多種細胞的體內(nèi)示蹤研究，如Treg細胞、間充質(zhì)干細胞、腫瘤細胞、造血干祖細胞等。 熒光染料，由于靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標記，其應用于熒光探針，細胞染色等。大連熒光染料DIR

選擇熒光染料時要考慮那些因素：激發(fā)波長處的消光系數(shù)應盡可能高：消光系數(shù)是衡量可以吸收多少光子的量度。量子產(chǎn)率應該盡可能高：這是吸收光子與發(fā)射光子的比率。消光系數(shù)和量子產(chǎn)率的乘積就是亮度。熒光染料應該是光穩(wěn)定的：遺憾的是，比較不同公司染料的光穩(wěn)定性的研究并不多。光致變色行為：對于STORM實驗，您需要一個閃爍的熒光團。但是，對于分子跟蹤實驗，您***不想要閃爍的熒光團?；?死細胞滲透性。您想要的反應側(cè)基（例如HaloTag、抗體等）。當您使用多個熒光探針時，尤其是當您量化共定位時，請謹慎處理其他顏色通道中的滲色。單獨測試所有熒光探針以評估滲透。新疆化合物熒光染料吲哚菁綠（Indocyanine Green，簡稱ICG）是一種廣泛應用于醫(yī)學和生物領(lǐng)域的熒光染料。

染料DiI, DiO, DiD 和 DiR是一類親脂性熒光染料家族，用于標記細胞膜和疏水性組織。這是一類環(huán)境敏感型熒光染料，當它們與膜結(jié)合或者與親脂性生物分子(例如蛋白質(zhì)，雖然在水中其熒光強度很弱)結(jié)合時，其熒光強度***增強。它們具有很高的淬滅系數(shù)，偏光依賴性和很短的激發(fā)壽命。一旦應用于細胞中，這種染料會在細胞內(nèi)質(zhì)膜中逐步擴散，導致在其比較好濃度條件下，將整個細胞染色。它們不同的熒光顏色：DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光），為活細胞多色彩熒光成像分析和流式細胞術(shù)提供了一種便捷的工具。DiO和DiI可以分別與標準的FITC和TRITC濾光器一同使用。其中，DiO可以被633 nm He-Ne激光激發(fā)，并且具有比DiI更長的激發(fā)和發(fā)射光波長，為標記細胞和組織的那些本身就具有本底熒光的染料提供了非常***的替代品。DiR在***成像或者示蹤中非常有用，因為它們所發(fā)射的紅外光可以高效地穿過細胞和組織，并且在紅外光范圍內(nèi)，其本底熒光水平很低。

FITC熒光標記蛋白的應用及特點:活性熒光染料，如FITC、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)、羅丹明B(RhodamineB)或AlexaFluor染料，可用于標記抗體或蛋白質(zhì)功能基團，生成分子探針，并通過熒光成像進行檢測。當用熒光染料化學標記特異性抗體或其他純化生物分子時，它們成為用于檢測靶抗原或相互作用配偶體的熒光探針，用于細胞成像、流式細胞手術(shù)、蛋白質(zhì)痕跡和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)。由于熒光標記物具有無放射物污染、操作簡單等優(yōu)點，在蛋白質(zhì)功能研究、藥物篩選等許多研究領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應用。

南京星葉生物科技有限公司Super Fluor 系列（效果同Alexa Fluor系列）

且Super Fluor活化酯（與Invitrogen的Alexa Fluor活化酯完全相同） Cy5.5含有一個游離胺基,可與多種官能團共軛,包括NHS酯和環(huán)氧化合物。

三、流式細胞儀分析1、取對數(shù)生長期的細胞，接種到孔板，過夜培養(yǎng)。2、如果要進行藥物刺激，在細胞中加入感興趣的藥物進行干預，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，收集細胞，PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重懸細胞，37℃避光孵育15min或更長時間。【注意】：由于細胞種類和實驗體系不同，Rhodamine123工作液濃度和孵育時間可以根據(jù)預實驗或參考文獻自行調(diào)整。4、用流式細胞儀檢測。

四、實驗案例1、取對數(shù)生長期A549細胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基）,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁，以便后續(xù)實驗操作.2、棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次.3、用培養(yǎng)基（無血清）稀釋Rh123母液制備1～20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細胞類型和細胞濃度。4、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細胞去除背景色.6、熒光顯微鏡觀察. Cy3染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別在550 nm和570 nm左右。廣西熒光染料IR780

南京星葉生物熒光染料標記蛋白。大連熒光染料DIR

熒光染料，由于靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標記，其廣泛應用于熒光免疫，熒光探針，細胞染色等。包括特異性的DNA染色，用于染色體分析、細胞周期、細胞凋亡等相關(guān)研究。另有很多核酸染料在多色染色系統(tǒng)中是非常有用的復染劑，可作為背景對照，標記細胞核使細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系一目了然。熒光標記的單克隆抗體技術(shù)為流式細胞儀在研究細胞膜和細胞內(nèi)各種功能性抗原、**基因蛋白等領(lǐng)域擴展了無限的應用空間。熒光探針可以通過蛋白質(zhì)交聯(lián)劑共價結(jié)合在單克隆抗體上。免疫熒光標記**常用的染料有異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、藻紅蛋白(PE)以及AlexaFluor系列染料等。核酸熒光染料對細胞核染色后定量測量細胞所發(fā)出的熒光強度，就可以確定細胞核中DNA、RNA的含量，并可以對細胞周期和細胞的增殖狀況進行分析。有多種熒光染料可以對細胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。大連熒光染料DIR