Cy3 (Cyanine 3) 是一種發(fā)橘黃色熒光的花青素熒光染料。Cy3染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰分別在550 nm和570 nm左右,它的熒光肉眼觀察很明亮,并且對pH不敏感,在共聚焦顯微鏡中可以用532nm(肩峰)或者556nm(頂峰)的激光束激發(fā),在普通熒光顯微鏡中可以用 TRITC (tetramethylrhodamine) 的濾片觀察,所以在絕大部分熒光儀器上都可以使用。Cy3也是Dil等細胞電位追蹤劑的母核,所以它是在生物技術(shù)中非常有用的熒光染料。在熒光成像時,Cy3的背景熒光一般認為比TAMRA等TRITC系列的染料低。 Cy3可以用來標記蛋白,抗體,多肽等,它常見的使用是標記核酸分子(DNA和RNA)?;跓晒鈭D譜的相似性,Cy3可以被TAMRA,TRITC, BODIPY TMR等染料替代,在需要更明亮,更穩(wěn)定的替代物時,可以考慮使用AF547或者AF555等。南京星葉生物熒光染料標記蛋白。顯微鏡熒光染料DIL
熒光染料,由于靈敏度高,操作方便,逐漸取代了放射性同位素作為檢測標記,其廣泛應(yīng)用于熒光免疫,熒光探針,細胞染色等。包括特異性的DNA染色,用于染色體分析、細胞周期、細胞凋亡等相關(guān)研究。另有很多核酸染料在多色染色系統(tǒng)中是非常有用的復(fù)染劑,可作為背景對照,標記細胞核使細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系一目了然。熒光標記的單克隆抗體技術(shù)為流式細胞儀在研究細胞膜和細胞內(nèi)各種功能性抗原、**基因蛋白等領(lǐng)域擴展了無限的應(yīng)用空間。熒光探針可以通過蛋白質(zhì)交聯(lián)劑共價結(jié)合在單克隆抗體上。免疫熒光標記**常用的染料有異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、藻紅蛋白(PE)以及AlexaFluor系列染料等。核酸熒光染料對細胞核染色后定量測量細胞所發(fā)出的熒光強度,就可以確定細胞核中DNA、RNA的含量,并可以對細胞周期和細胞的增殖狀況進行分析。有多種熒光染料可以對細胞中的DNA或RNA染色,常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst33342等,RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。多肽熒光染料熒光素鉀鹽FITC熒光染料標記方法。
羅丹明屬于呫噸族。與市場上的許多其他染料相比,羅丹明具有出色的光穩(wěn)定性以及許多光物理特性,使其非常適合用作激光染料、熒光探針和顏料。它們在聚合物納米粒子表面的表征、聚合物-生物偶聯(lián)物的檢測、活細胞的成像以及寡核苷酸在膠乳上的吸附分析等方面特別有用。羅丹明熒光染料的衍生物也用作:分子開關(guān),病毒表面修飾,化學傳感器,硫醇。不同類型的染料通過它們各自的取代基(R1、R2、R3、R4和G)來區(qū)分。由于它們的差異,這些熒光染料在溶液中也表現(xiàn)出不同的光物理特性(例如不同的熒光壽命和發(fā)射比較大值)。氨基被剛性化的羅丹明染料無論溫度范圍如何都表現(xiàn)出高量子產(chǎn)率,而在每個氮處具有兩個烷基取代基的那些表現(xiàn)出活化的內(nèi)部轉(zhuǎn)化,量子產(chǎn)率和熒光壽命隨溫度的變化而變化。羅丹明101和羅丹明B是一些**常用的羅丹明染料具有以下特點:--羧基傾向于在酸性溶液中質(zhì)子化--染料轉(zhuǎn)化為兩性離子堿性溶液--兩性離子染料在極性較小的有機溶劑中變?yōu)闊o色內(nèi)酯要將羅丹明用作熒光探針,必須對其進行修改。這可以通過(thexanthenemoiety)氨基、羧基苯基環(huán)或羧酸基團的修飾來實現(xiàn)。與TRITC一樣,羅丹明(NHS-rhodamine)的熒光特性為544nm(比較大吸收波長)和576nm(比較大發(fā)射)。
三、細胞實驗D-熒光素鉀鹽體外生物發(fā)光試驗:D-熒光素鉀鹽,無菌純水,完全培養(yǎng)基(自行配制)1、貼壁細胞:將細胞接種于培養(yǎng)板中孵育數(shù)小時或過夜,使細胞貼壁。懸浮細胞:可以將細胞接種于培養(yǎng)板后直接進行后續(xù)操作,無需孵育。如果倍增時間相對較短,則應(yīng)考慮倍增時間進行細胞計數(shù)。2、將15mg熒光素鉀鹽溶解于1ml無菌水中,制備成100X熒光素儲備液(15mg/ml),輕輕顛倒搖動至熒光素鉀鹽完全溶解?;靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。3、用預(yù)熱好的細胞培養(yǎng)基1∶100稀釋100X熒光素儲備液(15mg/ml),配制成熒光素工作液(終濃度150μg/ml),即配即用。4、去除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基。5、在成像前,將適量熒光素工作液加入細胞中,然后進行圖像分析。注意:成像前在37℃下對細胞進行短時間孵育可增強信號。孵育時間取決于特定的細胞類型。一般來說孵育10分鐘就足夠了,根據(jù)需要進行測試和調(diào)整。6、每隔10分鐘,**多40分鐘,使用VILBERFUSIONFX成像系統(tǒng)檢查體外生物發(fā)光,確定動力學曲線并找出細胞的峰值成像時間點PI是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑,它在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。
琥珀酰亞胺酯(Succinimidylesters)/NHS酯活性熒光染料用于標記抗體,蛋白質(zhì),肽,胺修飾的寡核苷酸和其他生物分子上的游離氨基(-NH2)2、馬來酰亞胺(Maleimides)活性熒光染料用于標記抗體,蛋白質(zhì)和肽上的巰基3、疊氮化物(Azides)活性熒光染料通過點擊化學法(Click)標記乙烯基4、炔烴(Alkynes)活性熒光染料通過點擊化學方法標記疊氮化物5、羧酸(Carboxylicacids)活性熒光染料經(jīng)碳二亞胺預(yù)活化后用于標記胺或用于醇的Steglich酯化6、氨基(Amines)活性熒光染料具有游離氨基的熒光染料,用于與各種親電子化合物(如活化的酯和環(huán)氧化物)偶聯(lián)。Cy5.5含有一個游離胺基,可與多種官能團共軛,包括NHS酯和環(huán)氧化合物。脂溶熒光染料發(fā)射
羅丹明具有出色的光穩(wěn)定性以及許多光物理特性,使其非常適合用作激光染料、熒光探針和顏料。顯微鏡熒光染料DIL
三、流式細胞儀分析1、取對數(shù)生長期的細胞,接種到孔板,過夜培養(yǎng)。2、如果要進行藥物刺激,在細胞中加入感興趣的藥物進行干預(yù),繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后,收集細胞,PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重懸細胞,37℃避光孵育15min或更長時間?!咀⒁狻浚河捎诩毎N類和實驗體系不同,Rhodamine123工作液濃度和孵育時間可以根據(jù)預(yù)實驗或參考文獻自行調(diào)整。4、用流式細胞儀檢測。
四、實驗案例1、取對數(shù)生長期A549細胞接于六孔板(1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基),37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁,以便后續(xù)實驗操作.2、棄掉培養(yǎng)液,PBS洗滌兩次.3、用培養(yǎng)基(無血清)稀釋Rh123母液制備1~20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細胞類型和細胞濃度。4、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細胞去除背景色.6、熒光顯微鏡觀察. 顯微鏡熒光染料DIL