注：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學(xué)曲線，從而確定比較高信號檢測時間和信號平臺期。保存和操作的過程中都要避光。另外水溶性儲存液過濾除菌后，可以-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復(fù)凍融。如果有條件，對儲存液充氮氣或氬氣（防止氧化），穩(wěn)定性和保存時間更長。 注射方式，動物類型以及體重等都會影響信號的發(fā)射，因此建議每次實驗都要做熒光素酶動力學(xué)曲線，確定比較好信號平臺期和比較好的檢測時間。熒光素鉀鹽和熒光素鈉鹽應(yīng)用上沒有差別，兩者的差別在于物理性狀上如外形和溶解性。鈉鹽的水溶性高于鉀鹽。從目前發(fā)表的文獻(xiàn)來看，鉀鹽的使用率遠(yuǎn)高于鈉鹽，尤其是體內(nèi)實驗。兩者功效相同。 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。小動物成像熒光染料是一種先進(jìn)的技術(shù)可以在小動物體內(nèi)實時觀察和研究細(xì)胞、組織的功能和代謝過程。陜西熒光染料Cy5.5

SuperFluor活化酯（與Invitrogen的AlexaFluor活化酯完全相同）SuperFlour系列熒光探針，具有更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，更廣的pH應(yīng)用范圍（pH4～10）,更好的抗淬滅性。在生物熒光領(lǐng)域已逐漸替代FITC,Cy3,Cy5,Cy5.5,Cy7等熒光染料。1．標(biāo)記效率低——計算結(jié)果顯示每摩爾145,000MW的蛋白標(biāo)記的熒光團(tuán)少于4mol有以下原因：1）緩沖液中含有痕量伯銨成分，與染料反應(yīng)降低了標(biāo)記效率。如果蛋白已經(jīng)溶于含氨基的緩沖液（如Tris或氨基乙酸），標(biāo)記前用PBS透析。2）蛋白含量較低(≤1mg/mL)會影響標(biāo)記效率。3）標(biāo)記步驟中加入碳酸氫鈉的作用是將反應(yīng)混合物的pH升高至～8，因為在弱堿性環(huán)境中標(biāo)記反應(yīng)的效率比較高。如果蛋白溶液的緩沖范圍在低pH，加入重碳酸鹽也無法將pH調(diào)節(jié)至**適水平。要么加大重碳酸鹽的量，要么將緩沖液換成PBS，或用0.1M碳酸氫鈉透析等。4）研究顯示pH升至9.0～9.4，標(biāo)記效率和標(biāo)記速度（只需10min）明顯改善。5）不同抗體與熒光團(tuán)的反應(yīng)速率不同，染料標(biāo)記后保留的生物活性程度也不同，因此標(biāo)準(zhǔn)步驟也不是總有比較好的標(biāo)記結(jié)果。為增加標(biāo)記率，可以對同一樣品進(jìn)行再標(biāo)記，或減少蛋白的量加大染料的量重新標(biāo)記。有研究者在室溫孵育1小時后再4℃孵育過夜，情況有所改善。組織熒光染料Fluor 750熒光染料可以單獨使用，也可以組合成復(fù)合熒光染料使用。

蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)是目前**為常見的蛋白體外標(biāo)記技術(shù)，利用級聯(lián)放大反應(yīng)原理，將極度敏感性且易于檢測的熒光素通過某個基團(tuán)吸附或共價結(jié)合后，標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記物因增強(qiáng)放大效應(yīng)而產(chǎn)生顏色、光譜等變化，以分析示蹤相應(yīng)抗體或抗原性質(zhì)與含量的方法。該技術(shù)在具有高度精確性的熒光顯微鏡下，借助高度靈敏性的熒光檢測，在各種生物過程中對目的蛋白進(jìn)行可視化，從而通過抗原抗體高度特異性免疫定量表達(dá)或在細(xì)胞研究中定位。蛋白熒光標(biāo)記已成為研究蛋白質(zhì)互作、酶活性、***示蹤以及細(xì)胞分選重要工具。蛋白標(biāo)記常用熒光染料隨著蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展，各類熒光素廣泛應(yīng)用于生物實驗中，目前常用標(biāo)記蛋白/抗體的熒光素主要有BODIPY類、香豆素類、羅丹明類、近紅外類、NBD胺類以及菁染料等。南京星葉生物科技有限公司提供多種性價比高的各類活化熒光素，其熒光染料覆蓋波長范圍從350nm到790nm，例如Cy系列、SuperFluor系列（效果同AlexaFluor系列）等，用于標(biāo)記抗體、多肽以及蛋白功能基團(tuán)，繼而生成分子探針，通過熒光成像進(jìn)行相應(yīng)檢測。

三、細(xì)胞實驗D-熒光素鉀鹽體外生物發(fā)光試驗：D-熒光素鉀鹽，無菌純水，完全培養(yǎng)基（自行配制）1、貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中孵育數(shù)小時或過夜，使細(xì)胞貼壁。懸浮細(xì)胞：可以將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板后直接進(jìn)行后續(xù)操作，無需孵育。如果倍增時間相對較短，則應(yīng)考慮倍增時間進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。2、將15mg熒光素鉀鹽溶解于1ml無菌水中，制備成100X熒光素儲備液（15mg/ml），輕輕顛倒搖動至熒光素鉀鹽完全溶解?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。3、用預(yù)熱好的細(xì)胞培養(yǎng)基1∶100稀釋100X熒光素儲備液（15mg/ml），配制成熒光素工作液（終濃度150μg/ml），即配即用。4、去除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基。5、在成像前，將適量熒光素工作液加入細(xì)胞中，然后進(jìn)行圖像分析。注意：成像前在37℃下對細(xì)胞進(jìn)行短時間孵育可增強(qiáng)信號。孵育時間取決于特定的細(xì)胞類型。一般來說孵育10分鐘就足夠了，根據(jù)需要進(jìn)行測試和調(diào)整。6、每隔10分鐘，**多40分鐘，使用VILBERFUSIONFX成像系統(tǒng)檢查體外生物發(fā)光，確定動力學(xué)曲線并找出細(xì)胞的峰值成像時間點DiD，DiO，DiI，DiR和DiS 染色的細(xì)胞可以分別用經(jīng)典的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和FL4流式細(xì)胞儀檢測。

熒光染料，由于靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標(biāo)記，其廣泛應(yīng)用于熒光免疫，熒光探針，細(xì)胞染色等。包括特異性的DNA染色，用于染色體分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等相關(guān)研究。另有很多核酸染料在多色染色系統(tǒng)中是非常有用的復(fù)染劑，可作為背景對照，標(biāo)記細(xì)胞核使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系一目了然。熒光標(biāo)記的單克隆抗體技術(shù)為流式細(xì)胞儀在研究細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)各種功能性抗原、**基因蛋白等領(lǐng)域擴(kuò)展了無限的應(yīng)用空間。熒光探針可以通過蛋白質(zhì)交聯(lián)劑共價結(jié)合在單克隆抗體上。免疫熒光標(biāo)記**常用的染料有異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、藻紅蛋白(PE)以及AlexaFluor系列染料等。核酸熒光染料對細(xì)胞核染色后定量測量細(xì)胞所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，就可以確定細(xì)胞核中DNA、RNA的含量，并可以對細(xì)胞周期和細(xì)胞的增殖狀況進(jìn)行分析。有多種熒光染料可以對細(xì)胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。熒光素衍生物具有高吸收率優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率和良好的水溶性是流式細(xì)胞儀和免疫熒光中常用的熒光標(biāo)記之一。組織熒光染料Fluor 750

吲哚菁綠的主要作用之一是在醫(yī)學(xué)影像學(xué)中作為造影劑。陜西熒光染料Cy5.5

3.粘壁細(xì)胞的染色（1）使粘壁的細(xì)胞在無菌實驗室培養(yǎng)。（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。（4）在37℃培養(yǎng)細(xì)胞2～20分鐘，不同的細(xì)胞比較好培養(yǎng)時間不同。（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預(yù)溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細(xì)胞，培養(yǎng)5～10分鐘，然后吸干培養(yǎng)基。

4.顯微鏡檢測（1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器的選擇參見表1。（2）多色染料的同時檢測，濾光器按照以下設(shè)定：a)DiI和DiO＝OmegaXF52，Chroma51004；b)DiI和DiD＝OmegaXF92，Chroma51007；c)DiI，DiO和DiD＝OmegaXF93，Chroma61005

5.流式細(xì)胞儀的檢測DiD，DiO，DiI，DiR和DiS染色的細(xì)胞可以分別用經(jīng)典的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和FL4流式細(xì)胞儀檢測。 陜西熒光染料Cy5.5