轉(zhuǎn)染試劑的凍融被認(rèn)為是另一個(gè)可能影響轉(zhuǎn)染效率的潛在因素。Lipofectamine2000試劑與非冷凍對(duì)照相比，至少經(jīng)歷一次凍融循環(huán)后，HEK293、Neuro2α、C2C12成肌細(xì)胞和肌管、hTERTMSC、SMA和HepG2細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率更高，且細(xì)胞活力不受影響。一種可能的解釋是，冷凍解凍可以增強(qiáng)分子重排分散，從而允許更高的分散率，從而允許核酸之間很大程度的接觸，形成更多的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然而，還需要更多的研究來(lái)支持這一做法，因?yàn)閮鋈谶^(guò)程也被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致再結(jié)晶，從而破壞一些化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)復(fù)合物又稱陽(yáng)離子脂質(zhì)-核酸復(fù)合物(CLNACs)。海南武漢轉(zhuǎn)染試劑

流式細(xì)胞術(shù)可以更精確地定量表達(dá)特定熒光基因的細(xì)胞，以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。另一種評(píng)估轉(zhuǎn)染效率的方法是通過(guò)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染后的特定蛋白表達(dá)。將轉(zhuǎn)基因引入細(xì)胞可能會(huì)改變由轉(zhuǎn)基因或細(xì)胞中其他基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。同樣，轉(zhuǎn)染小RNA也可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中特定下游遺傳靶點(diǎn)的表達(dá)。免疫印跡和免疫熒光染色可用于評(píng)估轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的變化。在這兩種方法中，使用特異性抗體結(jié)合靶蛋白是至關(guān)重要的，后者需要使用與一抗結(jié)合的熒光標(biāo)記二級(jí)抗體來(lái)檢測(cè)感興趣的蛋白質(zhì)。另一方面，在免疫印跡中，可以使用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗與一抗結(jié)合，進(jìn)行特異性蛋白檢測(cè)。免疫印跡法允許對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行半定量，而免疫熒光染色法允許通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。通過(guò)檢查特定蛋白表達(dá)來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率更具可重復(fù)性和直接性。然而，使用抗體所固有的非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合問(wèn)題和獲得假陰性結(jié)果的可能性，這可能是由于不及時(shí)測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)引起的，仍然是使用這些方法的缺點(diǎn)。懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑檢測(cè)共轉(zhuǎn)染是將一種以上類型的核酸引入真核細(xì)胞的過(guò)程。

人類原代干細(xì)胞是另一種公認(rèn)的難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染這種細(xì)胞類型的比較大挑戰(zhàn)仍然是效率低和細(xì)胞活力低。2015年，王等報(bào)道了Lipofectamine 2000和XtremeGENE HP等轉(zhuǎn)染試劑在人牙周韌帶干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率非常低(<6%)，而陽(yáng)性對(duì)照慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率約為95%。與同一研究中采用的磁輔助轉(zhuǎn)染技術(shù)相比，后者表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率(～11%)和更低的毒性。在另一項(xiàng)涉及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBM-MSC)的研究中，Lipofectamine LTX被證明比TransIT-2020、Lipofectamine 3000和聚乙烯亞胺(PEI)等其他試劑產(chǎn)生比較好的轉(zhuǎn)染效率(至少高出三倍)，但細(xì)胞存活率較低(<50%)。相比之下，使用TransIT-2020試劑可能會(huì)獲得更好的結(jié)果，該試劑的效率約為30%，細(xì)胞回收率高達(dá)90%，細(xì)胞干性約為95%。另一個(gè)難以轉(zhuǎn)染干細(xì)胞的例子是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)。在一項(xiàng)比較轉(zhuǎn)染人類ipsc衍生心肌細(xì)胞(hiPSC-CMSs)的不同非病毒方法的研究中，與其他試劑(Lipofectamine 3000、Lipofectamine 2000和基于pei的非脂質(zhì)體試劑TransporterTM5和PEI25)相比，Lipofectamine STEM顯示出更高的轉(zhuǎn)染效率(高達(dá)32%)，其效率低于20%。

在7種轉(zhuǎn)染試劑(DAC-30、DC-30、Lipofectin、LipofectAMINEPLUS、Effectene、FuGene 6和superect)中，F(xiàn)uGene 6轉(zhuǎn)染HASMCs和α-10 SMCs的效率比較高。在這兩種細(xì)胞系中，superect產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用比較高，其次是DAC-30和Lipofectamine Plus，而FuGene 6被認(rèn)為對(duì)細(xì)胞系相對(duì)安全。在另一項(xiàng)比較人類和動(dòng)物來(lái)源的不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染結(jié)果的研究中，豬氣管上皮細(xì)胞(PTE)被Effectene、Lipofectamine Plus和PEI等轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的效率高于人類氣管上皮細(xì)胞(HTE)。化學(xué)轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染后的HTE也表現(xiàn)出比PTE更低的活力。兩項(xiàng)被引用研究的綜合結(jié)果認(rèn)為動(dòng)物細(xì)胞系可能比人類細(xì)胞系更有效地轉(zhuǎn)染。懸浮細(xì)胞通常被認(rèn)為比貼壁細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，因?yàn)檗D(zhuǎn)染復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的潛在附著減少懸浮細(xì)胞表面。然而，一項(xiàng)比較Xfect、Lipofectamine2000、Nanofectamin、TransIT-X2和TransIT-2020效率的研究表明，除了Xfect之外，所有試劑轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞的效率都高于貼壁細(xì)胞(Tammetal.，2016)。然而，相反觀察結(jié)果背后的原因在很大程度上仍不清楚，未來(lái)可能會(huì)進(jìn)一步探索。核酸與轉(zhuǎn)染試劑的比例人類原代干細(xì)胞是另一種公認(rèn)的難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染這種細(xì)胞類型的挑戰(zhàn)仍然是效率低和細(xì)胞活力低。

基因注射包括通過(guò)注射將所需的核酸物質(zhì)直接輸送到宿主細(xì)胞核中。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染具有挑戰(zhàn)性時(shí)，特別是當(dāng)需要對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾時(shí)，這種方法是一種很好的替代方法。與其他非病毒基因傳遞方法一樣，沒(méi)有一種方法可以適用于所有不同的細(xì)胞類型，選擇合適的細(xì)胞類型和核酸大小對(duì)于確?；蜃⑸涞某晒χ陵P(guān)重要。例如，先前的一項(xiàng)研究報(bào)道了成功生成表達(dá)cre重組酶(大小～1,000bp)的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞系。另一方面，在一項(xiàng)體內(nèi)研究中，表達(dá)轉(zhuǎn)基因的小鼠肌纖維數(shù)量與注射次數(shù)和給藥質(zhì)粒劑量相關(guān)。另一項(xiàng)體外研究進(jìn)一步支持了這一觀點(diǎn)，該研究報(bào)道了表達(dá)報(bào)告基因的宿主細(xì)胞的數(shù)量與注入細(xì)胞的核酸量密切相關(guān)。此外，微針的大小、形狀和額外涂層的存在也會(huì)影響基因注射的效率，因?yàn)橛袌?bào)道稱，涂有微顆粒的小尺寸微針(<10毫米)能夠順利地將所需的貨物輸送到皮膚的角質(zhì)層。利用外泌體途徑的一種潛在方法是將脂質(zhì)體核酸重新包裝到外泌體中。安徽脾轉(zhuǎn)染試劑

由于CRISPR/Cas的發(fā)現(xiàn)，基因組編輯領(lǐng)域經(jīng)歷了一場(chǎng)變革。海南武漢轉(zhuǎn)染試劑

小RNA和質(zhì)粒DNA的共轉(zhuǎn)染可用于評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。這可以通過(guò)引入含有熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中的3'UTR可以被特定的小RNA(如miRNA)識(shí)別，然后允許小RNA結(jié)合以抑制熒光素酶的表達(dá)。另一方面，在RNA干擾(RNAi)研究中，小RNA和質(zhì)粒DNA的共轉(zhuǎn)染也是必不可少的，以確定siRNA等特定小RNA對(duì)宿主細(xì)胞中特定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。小的非編碼RNA，如siRNA，以其表觀遺傳調(diào)控能力而聞名，更具體地說(shuō)，是轉(zhuǎn)錄后對(duì)特定基因表達(dá)的調(diào)控。siRNA模擬物和攜帶與熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)相關(guān)的特定基因的質(zhì)粒DNA可以同時(shí)共轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞中。siRNA模擬物成功敲低特定基因表達(dá)將導(dǎo)致熒光素酶活性***降低。共轉(zhuǎn)染還可能涉及不同的小分子如miRNAs，這有助于研究小RNA對(duì)靶宿主細(xì)胞的影響。例如，如果引入miRNA模擬物可以影響特定細(xì)胞類型中特定下游基因的表達(dá)，那么預(yù)計(jì)將其抑制劑序列同時(shí)轉(zhuǎn)染到同一細(xì)胞中會(huì)降低單獨(dú)miRNA模擬物序列發(fā)揮的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。與單一核酸類型的轉(zhuǎn)染相比，涉及將多個(gè)核酸轉(zhuǎn)移到同一細(xì)胞中的共轉(zhuǎn)染通常更多挑戰(zhàn)性更大，因?yàn)椴⒎撬泻怂犷愋投寄苡行мD(zhuǎn)移，這可能取決于轉(zhuǎn)染方法和所涉及的細(xì)胞類型。海南武漢轉(zhuǎn)染試劑