在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中使用對(duì)照對(duì)于確定所使用的轉(zhuǎn)染試劑和核酸的效果和效率至關(guān)重要。通常，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和寡核苷酸轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)都需要陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、未轉(zhuǎn)染對(duì)照和模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照是先前已被證明對(duì)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生已知影響的DNA或RNA，例如影響特定下游遺傳靶點(diǎn)的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染工作的初始階段，需要一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照來(lái)建立一個(gè)優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方案，之后，陽(yáng)性對(duì)照可以作為參考，與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較。另一方面，陰性對(duì)照用于確認(rèn)宿主細(xì)胞中預(yù)期的基因表達(dá)變化是否歸因于轉(zhuǎn)染而不是其他原因。在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染中，陰性對(duì)照可以是缺乏DNA和轉(zhuǎn)染載體的反應(yīng)，或者兩者都沒(méi)有，只有宿主細(xì)胞。在小RNA轉(zhuǎn)染中，陰性對(duì)照包含一個(gè)非同源序列，該序列通常是一個(gè)與靶序列具有相同核苷酸長(zhǎng)度和組成但與任何已知哺乳動(dòng)物基因不同源的打亂序列。未轉(zhuǎn)染的對(duì)照包括不含轉(zhuǎn)染試劑和核酸的細(xì)胞培養(yǎng)，作為宿主細(xì)胞基本信息的對(duì)照，包括活力、表型，更重要的是，不受轉(zhuǎn)染影響的靶基因的基線表達(dá)水平。模擬轉(zhuǎn)染是指不含遺傳靶標(biāo)或核酸的轉(zhuǎn)染，可以評(píng)估轉(zhuǎn)染試劑(如背景自熒光噪聲)產(chǎn)生的影響。在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，推薦使用空質(zhì)粒對(duì)照作為模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。隨著寡核苷酸生物合成產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，不同類型的修飾寡核苷酸也被引入市場(chǎng)，以提高小RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染的效率。中國(guó)臺(tái)灣脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑

**近的研究已經(jīng)確定了陽(yáng)離子脂質(zhì)體（CLs）的某些特征，這些特征增強(qiáng)了它們?cè)隗w內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的能力。這些特征包括陽(yáng)離子頭基團(tuán)及其鄰近的脂肪鏈在主鏈上呈1,2關(guān)系，醚鍵用于橋接脂肪鏈到主鏈，成對(duì)的油基鏈作為疏水系鏈。無(wú)論如何，這些特征雖然不能決定細(xì)胞培養(yǎng)中更好的轉(zhuǎn)染能力，但可以在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)更好的核酸遞送。因此，必須謹(jǐn)慎對(duì)待體外和細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果，不能必然地用來(lái)推斷核酸載體在體內(nèi)的潛力。當(dāng)這些囊泡在體內(nèi)引入時(shí)，其他因素(如顆粒直徑)變得更加重要。使用脂質(zhì)體時(shí)遇到的毒性通常與制劑中陽(yáng)離子脂質(zhì)與核酸之間的電荷比、所使用的制劑類型以及所給脂質(zhì)體的劑量密切相關(guān)。較高的電荷比通常對(duì)多種細(xì)胞類型的毒性更大，包括*細(xì)胞系。另外，不同的試劑對(duì)細(xì)胞的毒性程度不同，毒性是細(xì)胞特異性的。目前市面上有超過(guò)30種不同的商用CL制劑品種可供選擇。由于毒性，脂質(zhì)體的體內(nèi)遞送必須盡可能靠近目標(biāo)部位，以盡量減少副作用。中國(guó)香港轉(zhuǎn)染試劑疫苗在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒通常含有二核苷酸頻率為1:16的CpG基序，這與細(xì)菌DNA中的頻率相似。

核酸與轉(zhuǎn)染試劑的比例對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有影響。在一項(xiàng)涉及原代人成肌細(xì)胞的研究中，使用不同的核酸比例來(lái)比較轉(zhuǎn)染效率的影響，轉(zhuǎn)染試劑包括FuGENE6、Effectene和ExGen500(一種基于pei的試劑)。該研究的一個(gè)***發(fā)現(xiàn)是，轉(zhuǎn)染效率可能不一定與所用試劑的體積直接相關(guān)。例如，2μgDNA與5μLFuGENE6試劑的比例被證明可以產(chǎn)生比較好的轉(zhuǎn)染效率，而更低或更高的DNA與試劑的比例并不能提高效率。在另一項(xiàng)涉及轉(zhuǎn)染人胃腺*細(xì)胞系的研究中也觀察到類似的發(fā)現(xiàn)，即在一系列組合中使用比較高轉(zhuǎn)染試劑與DNA比體積測(cè)試時(shí)，轉(zhuǎn)染效率并未達(dá)到比較好。使用不成比例的高轉(zhuǎn)染試劑量會(huì)導(dǎo)致不必要的細(xì)胞毒性，從而降低整體轉(zhuǎn)染結(jié)果。因此，確定合適的核酸與試劑比例是啟動(dòng)新的轉(zhuǎn)染研究以實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性的重要步驟。

PLL(聚L -賴氨酸)是生理?xiàng)l件下帶正電的多氨基酸,當(dāng)鏈長(zhǎng)超過(guò)20個(gè)殘基時(shí)，它可以與質(zhì)粒DNA結(jié)合并凝聚成致密顆粒。研究人員發(fā)現(xiàn)，配體在PLL上的共價(jià)附著可通過(guò)受體介導(dǎo)的途徑***增強(qiáng)內(nèi)吞作用。例如，涎腺樣體(ASOR)是涎腺糖蛋白受體的配體，在肝細(xì)胞上表達(dá)。當(dāng)ASOR共價(jià)附著在PLL上時(shí)，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和質(zhì)粒的細(xì)胞攝取***增加。此外，與葉酸或轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)的PLL已被開(kāi)發(fā)出來(lái)，并在將pDNAs轉(zhuǎn)染到*細(xì)胞中取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。另一種重要的聚氨基酸是PLO(聚L-鳥(niǎo)氨酸)。PLO具有PLL的特性，但轉(zhuǎn)染效率比PLL提高了10倍。Ramsay和Gumbleton證明，與PLL相比，PLO以更低的電荷(+/?)比率凝聚pDNA，并且在相同的多陽(yáng)離子/pDNA質(zhì)量比下，PLO/pDNA復(fù)合物比PLL/pDNA復(fù)合物更耐破壞。然而，由于其介導(dǎo)內(nèi)體逃逸的能力較差，帶正電的多氨基酸的轉(zhuǎn)染效率仍然很低。評(píng)估轉(zhuǎn)染效率至關(guān)重要，特別是在需要高轉(zhuǎn)染效率以保證特定下游靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的功能研究中。

在腺病毒載體或脂質(zhì)體的全身遞送后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)相對(duì)短暫。靜脈注射脂叢的肺表達(dá)比給藥后第1天和第2天觀察到的比較大表達(dá)量每周減少約1log。造成這種現(xiàn)象的機(jī)制可能有以下幾種:(a)產(chǎn)生針對(duì)外源基因產(chǎn)物的新***抗體，(b)細(xì)胞因子介導(dǎo)的啟動(dòng)子關(guān)閉，(c)通過(guò)凋亡、先天或適應(yīng)性免疫反應(yīng)根除表達(dá)細(xì)胞以及（d）表達(dá)基因的細(xì)胞因細(xì)胞凋亡而減少是導(dǎo)致表達(dá)減少。這些機(jī)制具有重要意義，因?yàn)椴豢赡苤貜?fù)給藥，而且轉(zhuǎn)基因凈表達(dá)會(huì)隨著時(shí)間的推移而減少。盡管通過(guò)中和或消除細(xì)胞因子的產(chǎn)生可以提高肺中的基因表達(dá)水平。靜脈給藥引起的毒性可能是由于小鼠轉(zhuǎn)氨酶水平的增加，在相同劑量下，小鼠肝臟出現(xiàn)組織病理學(xué)病變，但肺部沒(méi)有不良反應(yīng)。這種增加可以通過(guò)使用較少的細(xì)胞毒性陽(yáng)離子脂質(zhì)體（CLs）來(lái)控制。轉(zhuǎn)氨酶的釋放歸因于未甲基化的堿基，如pDNA序列中的胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤。常用的物理/機(jī)械轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔、聲孔、基因顯微注射和激光照射。天津轉(zhuǎn)染試劑定制

脂質(zhì)復(fù)合物(CLNACs)通過(guò)網(wǎng)格蛋白參與的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。中國(guó)臺(tái)灣脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑

目前核酸遞送系統(tǒng)的局限性之一是無(wú)法深入穿透組織和***，如實(shí)體瘤和大腦。通常情況下，只能到達(dá)并轉(zhuǎn)染細(xì)胞的外層，從而導(dǎo)致***效果不佳。愛(ài)潑斯坦巴爾病毒(EBV)，一種人類**病原體，似乎通過(guò)劫持**微環(huán)境中的外泌體進(jìn)行細(xì)胞間通訊來(lái)克服這一點(diǎn)。外泌體是小的膜囊泡(40 ~ 200nm)，起源于內(nèi)吞。在被釋放到細(xì)胞外環(huán)境后，由于其表面存在細(xì)胞識(shí)別分子，它們可以與鄰近細(xì)胞融合。外泌體外泌體是細(xì)胞間mRNA、小rna (miRNA)和信號(hào)因子的載體，通過(guò)經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)化和釋放的幾個(gè)周期，能夠跨越幾層組織。它們可以由多種細(xì)胞分泌，包括腫瘤細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、上皮細(xì)胞和神經(jīng)元。利用外泌體途徑的一種潛在方法是將脂質(zhì)體核酸重新包裝到外泌體中。這可以通過(guò)靶向外泌體特異性的膜蛋白(如四跨蛋白和膜聯(lián)蛋白)并啟動(dòng)脂質(zhì)體和外泌體之間的融合事件來(lái)實(shí)現(xiàn)。中國(guó)臺(tái)灣脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑