液相色譜類型

液相色譜按其分離機(jī)理，可分為四種類型--吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜、凝膠色譜法

分配色譜法

這種色譜的流動(dòng)相和固定相都是液體，樣品分子在兩個(gè)液相之間很快達(dá)到平衡分配，利用各組分在兩相中分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離，類似于萃取過程。

一般常用的固定液有β,β'-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEG400～4000)、三甲撐乙二醇(TMG)和角鯊?fù)?SQ)。采用與氣相色譜(GC)同樣的方法，將固定液涂漬在多孔的載體表面，但在使用中固定液易流失。目前，應(yīng)用較多的是鍵合固定相。在這種固體相中，固定液不是涂在載體表面，而是通過化學(xué)反應(yīng)在純硅膠顆粒表面鍵合上某種有機(jī)基團(tuán)。

例如，利用氯代十八烷基硅烷與硅膠表面的羥基(-OH)之間的反應(yīng)就可以形成一烷基化表面。這種固定液的優(yōu)點(diǎn)是不易被流動(dòng)相剝蝕。在分配色譜法中，流動(dòng)相可為純?nèi)軇?，也可以采用混合溶劑進(jìn)行梯度淋洗，其極性應(yīng)與固定液差別大一些，以避免兩者之間相溶。通?？煞譃檎喾峙浜头聪喾峙洹?

液相色譜理論

發(fā)展簡(jiǎn)況

液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)（常有幾個(gè)小時(shí)）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。

它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。

什么是液相色譜？

液相色譜是一類分離與分析技術(shù)，其特點(diǎn)是以液體作為流動(dòng)相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。在色譜技術(shù)發(fā)展的過程中．為了區(qū)分各種方法，根據(jù)固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名，如紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。

經(jīng)典液相色譜的流動(dòng)相是依靠重力緩慢地流過色譜柱，因此固定相的粒度不可能太小(100μm～150μm左右)。分離后的樣品是被分級(jí)收集后再進(jìn)行分析的，使得經(jīng)典液相色譜不僅分離效率低、分析速度慢，而且操作也比較復(fù)雜。直到20世紀(jì)60年代．發(fā)展出粒度小于10μm的高效固定相，并使用了高壓輸液泵和自動(dòng)記錄的檢測(cè)器，克服了經(jīng)典液相色譜的缺點(diǎn)，發(fā)展成高效液相色譜，也稱為高壓液相色譜。

賽默飛高效液相色譜業(yè)務(wù)副總裁兼總經(jīng)理Fraser McLeod表示：“在整個(gè)生物制藥的流程中，從藥物研發(fā)到質(zhì)控的批次放行，數(shù)據(jù)完整性對(duì)于決策是必不可少的。為快速獲取可靠結(jié)果，靈敏度和通量非常關(guān)鍵。我們開發(fā)出的這套系統(tǒng)展示出在復(fù)雜分析應(yīng)用時(shí)的**辨分離和重復(fù)性?！?

? Vanquish Flex UHPLC系統(tǒng)采用獨(dú)特設(shè)計(jì)，即便在高通量的情況下，仍可以保證分析物色譜峰擁有尖銳峰形，實(shí)現(xiàn)在較短時(shí)間內(nèi)分析更多樣品。該系統(tǒng)良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性為數(shù)據(jù)質(zhì)量提供了可靠保障，確保能夠分析大量的樣品，以供質(zhì)控分析比較。其重要特點(diǎn)如下：

? 新型四元梯度泵模塊，設(shè)計(jì)穩(wěn)健，性能良好，保證高通量的前提下依然可提供方法開發(fā)的靈活性。

? 泵比較大耐壓 1000 bar，性能***，流速高達(dá) 8 mL/min，應(yīng)用靈活，可實(shí)現(xiàn)**辨分離。

? 新型熒光檢測(cè)器模塊靈敏度高，與高靈敏度、寬線性范圍的UV、DAD檢測(cè)器和針對(duì)非揮發(fā)性化合物的電霧式檢測(cè)器互為補(bǔ)充。

雙恒溫模式：蒸餾氣體和加壓氣體。

高效液相色譜分離原理

液-液分配

(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí)，服從于高效液相色譜計(jì)算公式：

式中，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度；cm—溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動(dòng)相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動(dòng)相對(duì)K影響不大，LLPC流動(dòng)相對(duì)K影響較大。

a.正相液-液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。

b.反相液-液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。

c.液-液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解；流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相（見后），可克服上述缺點(diǎn)。

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液相色譜類型

液相色譜按其分離機(jī)理，可分為四種類型--吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜、凝膠色譜法

吸附色譜法

吸附色譜法的固定相為吸附劑，色譜的分離過程是在吸附劑表面進(jìn)行的，不進(jìn)入固定相的內(nèi)部。與氣相色譜不同，流動(dòng)相(即溶劑)分子也與吸附劑表面發(fā)生吸附作用。在吸附劑表面，樣品分子與流動(dòng)相分子進(jìn)行吸附競(jìng)爭(zhēng)，因此流動(dòng)相的選擇對(duì)分離效果有很大的影響，一般可采用梯度淋洗法來提高色譜分離效率。

在聚合物的分析中，吸附色譜一般用來分離添加劑，如偶氮染料、抗氧化劑、表面活性劑等，也可用于石油烴類的組成分析。