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Real-time PCR相對(duì)定量中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法如何進(jìn)行：主要是相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的制作，一般有三種方法：1、比較復(fù)雜的方法：質(zhì)粒，采用Biotnt提供內(nèi)參基因的特異性Real-time PCRmRNA引物，對(duì)目的基因進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，得到PCR...

Real-time PCR的染料法和探針?lè)ǖ倪x擇：進(jìn)行mRNA表達(dá)量的測(cè)定，采用染料法是比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的；染料法可以通過(guò)比較熔解曲線(xiàn)的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況；目的基因和內(nèi)參基因分管檢測(cè)，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針?lè)ㄖ饕獞?yīng)用...

胎牛血清如何采取?在牛屠宰過(guò)程中，如發(fā)現(xiàn)母牛懷孕，就應(yīng)立即將生殖系統(tǒng)從尸體中分離出來(lái)，在無(wú)菌條件下從子宮中取出小牛，進(jìn)行臍帶打結(jié)處理，清理羊水并消毒。在胎兒兩肋之間直接插入一根針頭到心臟，在真空的條件下，血液通過(guò)導(dǎo)管被抽入無(wú)菌的血液收集袋內(nèi)。在沒(méi)有真空泵時(shí)，也...

Real-time PCR鏈反應(yīng)：嵌套聚合酶鏈反應(yīng):通過(guò)減少DNA非特異性擴(kuò)增的背景，提高DNA擴(kuò)增的特異性。兩組引物用于兩個(gè)連續(xù)的PCR。在個(gè)反應(yīng)中，一對(duì)引物用于產(chǎn)生DNA產(chǎn)物，除了預(yù)期的靶之外，該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴(kuò)增的DN段組成。然后用一組引物將產(chǎn)物...

膜片鉗法的各種模式：細(xì)胞吸附模式：將膜片微電極吸附在細(xì)胞膜上對(duì)但離子通道電流進(jìn)行記錄的模式。其優(yōu)點(diǎn)是在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境保持正常的條件下可以對(duì)離子通道活動(dòng)進(jìn)行觀(guān)察記錄。但是由于不能認(rèn)為直接地控制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境條件也不能確切的潘明細(xì)胞內(nèi)點(diǎn)位，所以其缺點(diǎn)是不清楚膜片上的實(shí)效點(diǎn)...

膜片鉗的數(shù)據(jù)如何處理：1）細(xì)胞吸附式膜片(cell attached patch)是膜片鉗的基本方式,其它方式由此衍生。這種膜片形式比較穩(wěn)定因細(xì)胞骨架及有關(guān)代謝過(guò)程是完整的,故對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和環(huán)境干擾比較小。但這種膜片形式易在電極形成囊泡,從而細(xì)胞骨架可能有所變化...

膜片鉗技術(shù)的基本原理和方法：膜片鉗使用的基本方法是，把經(jīng)過(guò)加熱拋光的玻璃微電極在液壓推進(jìn)器的操縱下，與清潔處理過(guò)的細(xì)胞膜形成高阻抗封接，導(dǎo)致電極內(nèi)膜片與電極外的膜在電學(xué)上和化學(xué)上隔離起來(lái)，由于電性能隔離與微電極的相對(duì)低電阻（1～5MΩ），只要對(duì)微電極施以電壓就...

Real-time PCR反應(yīng)：多重連接依賴(lài)探針擴(kuò)增（MLPA):允許用單個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)，從而避免多重PCR的分辨率限制。多重聚合酶鏈反應(yīng):由單個(gè)PCR混合物中的多個(gè)引物組組成，以產(chǎn)生對(duì)不同DNA序列特異的不同大小的擴(kuò)增子。通過(guò)同時(shí)靶向多個(gè)基因，可以從單...

Real-time PCR：1.DNA或RNA的定量分析：Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè),轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi基因失活率的檢測(cè)等；2.基因表達(dá)差異分析：例如比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物...

細(xì)胞培養(yǎng)用到的胎牛血清需要滅活嗎：細(xì)胞培養(yǎng)胎牛血清是不可或缺重要培養(yǎng)基，胎牛血清中含有諸多細(xì)胞生長(zhǎng)因子，維生素，氨基酸等物質(zhì)。我們常會(huì)看到胎牛血清的標(biāo)注上有對(duì)產(chǎn)品滅活也有沒(méi)有滅活的，胎牛血清為什么不需要熱滅活便可以使用。事實(shí)上，熱滅活目的是為了去除血清中補(bǔ)體等...

電壓鉗與膜片鉗有什么區(qū)別？電壓鉗技術(shù)是通過(guò)向細(xì)胞內(nèi)注射一定的電流，抵消離子通道開(kāi)放時(shí)所產(chǎn)生的離子流，從而將細(xì)胞膜電位固定在某一數(shù)值。由于注射電流的大小與離子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映離子流的大小和方向。膜片鉗技術(shù)鉗制的是膜片，是指采用尖銳端經(jīng)過(guò)處理...

膜片鉗的應(yīng)用：在心血管藥理研究中的應(yīng)用：隨著膜片鉗技術(shù)在心血管方面的普遍應(yīng)用，對(duì)血管疾病和藥物作用的認(rèn)識(shí)不只得到了不斷更新，而且在其病因?qū)W與藥理學(xué)方面還形成了許多新的觀(guān)點(diǎn)。正如諾貝爾基金會(huì)在頒獎(jiǎng)時(shí)所說(shuō)：“Neher和Sadmann的貢獻(xiàn)有利于了解不同疾病機(jī)理，...

全自動(dòng)膜片鉗的優(yōu)勢(shì)：自動(dòng)化：抓取細(xì)胞、形成封接、破膜等整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作全部自動(dòng)化，極大的節(jié)約實(shí)驗(yàn)人員的時(shí)間精力。簡(jiǎn)約化：傳統(tǒng)膜片鉗所需要的顯微鏡、顯微操作系統(tǒng)、微電極拉制儀，防震臺(tái)、屏蔽網(wǎng)等全都不需要。效率高：是傳統(tǒng)膜片鉗實(shí)驗(yàn)效率的5-10倍?？煽啃裕簩?shí)驗(yàn)結(jié)果輕松...

胎牛血清(FBS)是來(lái)自胎牛的凝結(jié)血液的液體部分，不含細(xì)胞、纖維蛋白和凝血因子，但含有大量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要的營(yíng)養(yǎng)和大分子因子。牛血清白蛋白是FBS的主要成分。FBS中的生長(zhǎng)因子對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的維持和生長(zhǎng)至關(guān)重要。FBS還含有多種小分子，如氨基酸、糖、脂質(zhì)和Ho...

膜片鉗技術(shù)是通過(guò)微玻管電極（膜片電極或膜片吸管）接觸細(xì)胞膜，用千兆歐姆以上的阻抗使之封接，在電學(xué)上分隔和電極尖開(kāi)口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域（膜片）以及其周?chē)诖嘶A(chǔ)上固定點(diǎn)位，對(duì)這膜片上的離子通道的離子電流（pA級(jí)）進(jìn)行監(jiān)測(cè)記錄的方法。測(cè)量回路的中心部分是使用...

Real-time PCR雙熒光標(biāo)記探針設(shè)計(jì)原則：具體的其他要求可以具體聯(lián)系設(shè)計(jì)公司，拿到合成好的引物，需要先確認(rèn)引物的性能?？梢杂眠@對(duì)引物先擴(kuò)增梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品介紹見(jiàn)后續(xù)內(nèi)容）。由不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品的加量和其對(duì)應(yīng)的Ct值，描繪出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。這里要注意...

細(xì)胞培養(yǎng)用到的胎牛血清需要滅活嗎：細(xì)胞培養(yǎng)胎牛血清是不可或缺重要培養(yǎng)基，胎牛血清中含有諸多細(xì)胞生長(zhǎng)因子，維生素，氨基酸等物質(zhì)。我們常會(huì)看到胎牛血清的標(biāo)注上有對(duì)產(chǎn)品滅活也有沒(méi)有滅活的，胎牛血清為什么不需要熱滅活便可以使用。事實(shí)上，熱滅活目的是為了去除血清中補(bǔ)體等...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。因此，無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一...

膜片鉗系統(tǒng)有如下應(yīng)用局限性(1)光能應(yīng)用于懸浮細(xì)胞的紀(jì)錄，因此大部分的紀(jì)錄對(duì)象為化細(xì)胞，而對(duì)于需要貼壁生長(zhǎng)的大多數(shù)正常細(xì)胞，現(xiàn)有的自動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)就無(wú)法紀(jì)錄；(2)在紀(jì)錄對(duì)象上，目前的膜片鉗系統(tǒng)只能紀(jì)錄胞膜形狀平整飽滿(mǎn)的細(xì)胞，大部分是工具細(xì)胞如化細(xì)胞，此類(lèi)細(xì)胞有...

引物的設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)：1，引物設(shè)計(jì)要跨內(nèi)含子，不能在一個(gè)外顯子上（我們的實(shí)驗(yàn)是以cDNA為模板來(lái)擴(kuò)增的，如果有DNA污染的話(huà)，因?yàn)镈NA上含有分子量很大的內(nèi)含子，不可能完成擴(kuò)增。這對(duì)我們消除整個(gè)實(shí)驗(yàn)的誤差起很大的作用）。2，引物設(shè)計(jì)的時(shí)候要盡可能設(shè)計(jì)在同一退火溫...

膜片鉗實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞膜型：一個(gè)完整的細(xì)胞膜電學(xué)模型包含幾個(gè)基本組分：膜電容，膜電阻和膜電勢(shì)。這三個(gè)電學(xué)組分形成的原因各不相同：1、膜電容（membranecapacitance,Cm）的形成是由于生物膜為磷脂雙分子層，對(duì)離子和其他水溶性物質(zhì)均不通透，遂使細(xì)胞膜成為...

胎牛血清：胎牛血清用于細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)超過(guò)半個(gè)世紀(jì)了，20世紀(jì)50年代末TheodorePuck在細(xì)胞和組織培養(yǎng)中初次加入胎牛血清（FBS）來(lái)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，由于胎牛未進(jìn)食過(guò)母乳，所以IgG的含量極低，不會(huì)阻礙細(xì)胞生長(zhǎng)，而且胎牛血清中含有豐富的促進(jìn)細(xì)胞...

膜片鉗技術(shù)基本原理與特點(diǎn)：膜片鉗技術(shù)本質(zhì)上也屬于電壓鉗范疇，兩者的區(qū)別關(guān)鍵在于：①膜電位固定的方法不同；②電位固定的細(xì)胞膜面積不同，進(jìn)而所研究的離子通道數(shù)目不同。電壓鉗技術(shù)主要是通過(guò)保持細(xì)胞跨膜電位不變，并迅速控制其數(shù)值，以觀(guān)察在不同膜電位條件下膜電流情況。因...

Real-timePCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過(guò)高會(huì)加快反應(yīng)速度，但同時(shí)還可以增加堿基的錯(cuò)誤摻入率。引物濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。TaqDNA聚合酶濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，低則合成產(chǎn)物量減少。TaqDNA聚合酶無(wú)校正功能，摻入錯(cuò)誤率...

膜片鉗技術(shù)之全細(xì)胞記錄的優(yōu)點(diǎn)：與傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)記錄相比，全細(xì)胞記錄也有很多好處，比如電極尖銳端開(kāi)口較大，電阻只2~20MΩ，易于進(jìn)行電壓/電流鉗制，噪聲很大程度下降，電極電壓降也變得很小，補(bǔ)償非常容易。與單通道記錄相比，單通道記錄無(wú)法獲得整個(gè)細(xì)胞的功能變化信息，...

膜片鉗實(shí)驗(yàn)中電極制備之分兩次拉制，首先次拉長(zhǎng)7～10mm，直徑小于200μm，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行第二次拉制，較終使尖銳端的直徑為1～2μm，兩步拉制的目的主要是使電極前端的錐度變大，狹窄部長(zhǎng)度縮短，因此可降低電極的串聯(lián)電阻，也可減少全細(xì)胞記錄時(shí)的電極液透析時(shí)間。由...

Real-time PCR：對(duì)擴(kuò)增技術(shù)的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈。聚合酶鏈反應(yīng)有許多應(yīng)用于傳統(tǒng)的DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體，這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”，它還可以分析或提取已經(jīng)插入...

膜片鉗實(shí)驗(yàn)中電極制備之分兩次拉制，首先次拉長(zhǎng)7～10mm，直徑小于200μm，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行第二次拉制，較終使尖銳端的直徑為1～2μm，兩步拉制的目的主要是使電極前端的錐度變大，狹窄部長(zhǎng)度縮短，因此可降低電極的串聯(lián)電阻，也可減少全細(xì)胞記錄時(shí)的電極液透析時(shí)間。由...

Real-time PCR：1.DNA或RNA的定量分析：Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè),轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi基因失活率的檢測(cè)等；2.基因表達(dá)差異分析：例如比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物...

膜片鉗技術(shù)是通過(guò)微玻管電極（膜片電極或膜片吸管）接觸細(xì)胞膜，用千兆歐姆以上的阻抗使之封接，在電學(xué)上分隔和電極尖開(kāi)口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域（膜片）以及其周?chē)?，在此基礎(chǔ)上固定點(diǎn)位，對(duì)這膜片上的離子通道的離子電流（pA級(jí)）進(jìn)行監(jiān)測(cè)記錄的方法。測(cè)量回路的中心部分是使用...