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溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理

來源： 發(fā)布時間：2024-06-20

RIP實驗步驟通常包括：
1. 細胞收集與交聯(lián)：培養(yǎng)細胞至適當密度。使用交聯(lián)劑（如甲醛）進行交聯(lián)，以固定蛋白質(zhì)-RNA復合物。
2. 細胞裂解：收集細胞并進行裂解，釋放RNA-蛋白質(zhì)復合物。在裂解過程中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解。
3. 超聲處理：使用超聲波破壞細胞，獲得更小的染色質(zhì)片段，這有助于后續(xù)步驟中抗體的接觸。
4. 除去細胞碎片：通過離心去除細胞碎片和未裂解的細胞，收集含RNA-蛋白質(zhì)復合物的上清液。
5. 免疫沉淀：將針對特定RNA結(jié)合蛋白（RBP）的抗體加入到上清液中。孵育一段時間，使抗體與目標蛋白充分結(jié)合。
6. 捕獲免疫復合物：添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的磁珠或瓊脂糖珠。孵育使抗體-蛋白質(zhì)-RNA復合物與珠子結(jié)合。
7. 洗滌：多次洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
8. 洗脫與逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：使用適當?shù)木彌_液洗脫免疫復合物。使用蛋白酶K處理樣品以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，釋放RNA。
9. RNA提取與純化：從免疫沉淀樣品中提取RNA，并進行純化。
10. RNA分析：使用qPCR、Northern blot、RNA-Seq等方法分析沉淀的RNA，以確定與目標蛋白相互作用的RNA種類。
免疫沉淀技術(shù)RIP的優(yōu)缺點是什么？溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理

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RIP 技術(shù)的原理（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀）主要是運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復合物上的RNA 進行q-PCR驗證或者測序分析。

RIP 是研究細胞內(nèi)RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡動態(tài)過程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應用，但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物，RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同，如：RIP反應體系中的試劑和抗體不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實驗驗證等等。
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免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)特性的重要方法。它具有一些明顯的優(yōu)點，但也存在一些局限性。
優(yōu)點:
1. 特異性強：IP技術(shù)利用特異性抗體對目標蛋白進行捕獲，因此具有很高的特異性。
2. 富集低豐度蛋白：可以從小量樣本中富集低豐度的目標蛋白，有助于研究稀有蛋白。
3. 研究蛋白質(zhì)相互作用：通過Co-IP等變體技術(shù)，可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。
4. 操作簡便：IP實驗步驟相對簡單，容易在實驗室中實施。

缺點:
1. 對抗體質(zhì)量依賴性高：需要高質(zhì)量的特異性抗體，否則可能導致假陽性或?qū)嶒炇　?
2. 存在非特異性結(jié)合：樣本中的其他蛋白質(zhì)可能非特異性地結(jié)合到抗體或固相載體上。
3. 可能破壞蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象：裂解和洗滌步驟可能破壞蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，影響其功能。
4. 可能存在背景噪聲：非特異性結(jié)合可能導致背景噪聲，影響結(jié)果的清晰度和解釋。

免疫沉淀實驗中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實驗情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu)  (直徑 50-150 μm)  可以結(jié)合抗體  (繼而結(jié)合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體，而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu)，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸，具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡而言之，瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強，而磁珠在得率，可重復性以及自動化方面有明顯的優(yōu)勢。
免疫沉淀技術(shù)IP的優(yōu)缺點是什么？

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Co-IP（免疫共沉淀）技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，其實驗設(shè)計如下：
1. 樣品準備：Co-IP實驗通常有兩種，一種是內(nèi)源性蛋白相互作用驗證，一種是非內(nèi)源性蛋白相互作用驗證。內(nèi)源性相互作用通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方式將兩種蛋白轉(zhuǎn)染至同一細胞內(nèi)表達；非內(nèi)源性相互作用則是將含有靶蛋白的組織進行預處理及細胞裂解獲得細胞裂解液。
2. 沉淀誘餌蛋白：利用磁珠偶聯(lián)抗體沉淀誘餌蛋白。在樣品中加入磁珠偶聯(lián)抗體，抗體會與誘餌蛋白結(jié)合，利用磁鐵將磁珠拉下，同時誘餌蛋白會一起被沉淀出來。
3. SDS-PAGE及WB檢測：得到沉淀后，需要驗證沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE將蛋白復合物分離，隨后利用WB檢測是否存在靶蛋白。
4. 實驗對照設(shè)置：為了避免“假陽性”，需要設(shè)置正確的對照，包括陰性對照和陽性對照（Input組）。Input組為直接利用抗體對細胞裂解液進行WB檢測，驗證細胞裂解液中存在蛋白。
5. 結(jié)果真實性：確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白。使用單克隆抗體有助于避免污染的發(fā)生。
免疫沉淀技術(shù)ChIP的實驗方法。蘇州Co IP免疫沉淀選磁珠還是瓊脂糖珠

免疫沉淀技術(shù)是什么？溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理

免疫沉淀IP實驗中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實驗情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu)  (直徑 50-150 μm)  可以結(jié)合抗體  (繼而結(jié)合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體，而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu)，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸，具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡而言之，瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強，而磁珠在得率，可重復性以及自動化方面有明顯的優(yōu)勢。
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