免疫沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵,因?yàn)榭贵w的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗(yàn)的成功與否。
1. 特異性:抗體應(yīng)當(dāng)對(duì)目標(biāo)蛋白具有高度的特異性,以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合,導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
2. 親和力:抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高,以確保在免疫沉淀過(guò)程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類型:?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體都可以用于IP實(shí)驗(yàn)。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性,而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗(yàn)證:選擇已經(jīng)過(guò)免疫沉淀(Co-IP)或相關(guān)應(yīng)用(如Western blot, IHC)驗(yàn)證的抗體,這增加了實(shí)驗(yàn)成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息:選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商,并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評(píng)價(jià),以幫助做出決策。
免疫沉淀技術(shù)IP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。北京anti DYKDDDDK免疫沉淀實(shí)驗(yàn)視頻
Co-IP(Co-Immunoprecipitation,共免疫沉淀)的實(shí)驗(yàn)方法通常包括以下步驟:
1. 細(xì)胞培養(yǎng)與裂解:細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)拿芏取?/span>
蛋白質(zhì)分離:裂解后的細(xì)胞混合物通過(guò)離心去除未破碎的細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞。收集上清液
2. 抗體的添加:將特異性抗體(針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體)加入到裂解物中。
3. 免疫復(fù)合物的形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后,形成免疫復(fù)合物。
4. 親和介質(zhì)的使用:向混合物中添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子(如瓊脂糖或磁性珠子)。
5. 免疫復(fù)合物的捕獲:將混合物與珠子孵育一段時(shí)間后,使用磁鐵或離心的方法將珠子收集起來(lái),同時(shí)捕獲了與之結(jié)合的免疫復(fù)合物。
6. 洗滌:洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他分子。
7. 洗脫:使用適當(dāng)?shù)木彌_液將免疫復(fù)合物從珠子上洗脫下來(lái),常用的緩沖液包括SDS樣品緩沖液,用于后續(xù)的電泳分析。
8. 蛋白質(zhì)分析:洗脫的蛋白質(zhì)可以通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳、Western blot、質(zhì)譜分析等方法進(jìn)行進(jìn)一步分析。
9. 實(shí)驗(yàn)對(duì)照:實(shí)驗(yàn)中應(yīng)包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
10. 數(shù)據(jù)分析:對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,確認(rèn)目標(biāo)蛋白是否成功沉淀,并鑒定任何可能的相互作用蛋白。
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RIP實(shí)驗(yàn)步驟通常包括:
1. 細(xì)胞收集與交聯(lián):培養(yǎng)細(xì)胞至適當(dāng)密度。使用交聯(lián)劑(如甲醛)進(jìn)行交聯(lián),以固定蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
2. 細(xì)胞裂解:收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解,釋放RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在裂解過(guò)程中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解。
3. 超聲處理:使用超聲波破壞細(xì)胞,獲得更小的染色質(zhì)片段,這有助于后續(xù)步驟中抗體的接觸。
4. 除去細(xì)胞碎片:通過(guò)離心去除細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞,收集含RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的上清液。
5. 免疫沉淀:將針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白(RBP)的抗體加入到上清液中。孵育一段時(shí)間,使抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合。
6. 捕獲免疫復(fù)合物:添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的磁珠或瓊脂糖珠。孵育使抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物與珠子結(jié)合。
7. 洗滌:多次洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
8. 洗脫與逆轉(zhuǎn)交聯(lián):使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫免疫復(fù)合物。使用蛋白酶K處理樣品以逆轉(zhuǎn)交聯(lián),釋放RNA。
9. RNA提取與純化:從免疫沉淀樣品中提取RNA,并進(jìn)行純化。
10. RNA分析:使用qPCR、Northern blot、RNA-Seq等方法分析沉淀的RNA,以確定與目標(biāo)蛋白相互作用的RNA種類。
免疫沉淀Co-IP實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu) (直徑 50-150 μm) 可以結(jié)合抗體 (繼而結(jié)合靶蛋白) ,它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體,而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu),這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸,具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同,磁珠是固體,抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ,盡管磁珠沒(méi)有多孔中心增加結(jié)合能力,但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多,使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡(jiǎn)而言之,瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng),而磁珠在得率,可重復(fù)性以及自動(dòng)化方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。
免疫沉淀和免疫共沉淀的區(qū)別?
免疫沉淀(immunoprecipitation)是指利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性,將抗原(常為靶蛋白)從混合體系沉淀下來(lái),初步分離靶蛋白的一種方法。免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)是一種在體外探測(cè)兩個(gè)蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。其原理非常簡(jiǎn)單,如果兩個(gè)蛋白在體外體系能夠發(fā)生特異性相互作用的話,那么當(dāng)用一種蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀時(shí),另一個(gè)蛋白也會(huì)被同時(shí)沉淀下來(lái)。與酵母雙雜交技術(shù)不同,免疫共沉淀技術(shù)所利用的是抗原和抗體間的免疫反應(yīng),是一種基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的方法。
免疫沉淀RIP技術(shù)選瓊脂糖珠還是磁珠?杭州RIP免疫沉淀磁珠哪個(gè)公司好用
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免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)復(fù)合物組成以及特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
基本原理
免疫沉淀技術(shù)基于抗體與特定蛋白質(zhì)(抗原)之間的特異性相互作用。通過(guò)使用針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體,可以從含有多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜樣本中捕獲并富集目標(biāo)蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)有多種類型,包括:
1. 個(gè)別免疫沉淀法(Individual IP)
2. 免疫共沉淀法(Co-IP)
3. 染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)
4. RNA免疫沉淀法(RIP)
近年來(lái),免疫沉淀技術(shù)在固相支持物的選擇上有了很大進(jìn)步。磁性微珠因其操作簡(jiǎn)便、快速和自動(dòng)化程度高而逐漸取代了傳統(tǒng)的瓊脂糖樹(shù)脂。
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