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來源： 發(fā)布時間：2024-07-15

免疫沉淀純化所得抗原純度低一般有多種原因：
1. 非特異性蛋白污染
如果洗脫所得抗原純度較低，則有幾種方法可以進行優(yōu)化。在結(jié)合或洗滌緩沖液中加入去污劑或其他可以降低非特異性結(jié)合的組分。使用普通微珠預(yù)純化樣本還可以降低非目標(biāo)分子的共純化。此外，還可以使用無關(guān)蛋白 (如BSA) 封閉微珠 。
2. 抗體污染
使用蛋白A、G或A/G的經(jīng)典免疫沉淀實驗中會出現(xiàn)抗體與抗原共洗脫的情況。如果共洗脫會影響下游分析，則需要使用抗體通過共價連接固定至微珠的方法進行實驗，如Pierce 直接 IP 或交聯(lián) IP 的形式。
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免疫沉淀技術(shù)RIP（RNA Immunoprecipitation，RNA免疫沉淀）的實驗方法基于以下幾個關(guān)鍵步驟：
1. 細胞裂解：首先，細胞或組織樣本被裂解，以釋放細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和RNA復(fù)合物。
2.抗體特異性結(jié)合：裂解后的樣本中加入針對特定RNA結(jié)合蛋白的抗體。這些抗體能夠特異性地識別并結(jié)合到目標(biāo)蛋白。
3. 免疫復(fù)合物形成：抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后，形成抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
4. 親和介質(zhì)捕獲：使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子（如瓊脂糖或磁性珠子）來捕獲這些抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。蛋白A或蛋白G能夠與抗體的Fc部分結(jié)合，從而拉下與之結(jié)合的復(fù)合物。
5. 洗滌：捕獲的復(fù)合物被洗滌以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
6. RNA分離和分析：從珠子上洗脫或消化復(fù)合物，分離出RNA，并進行進一步的分析，如qPCR、Northern blot或高通量測序（RNA-Seq）。
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免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）是一種利用抗體與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的特性，從復(fù)雜樣本中分離和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的實驗方法。這項技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用場景，以下是一些主要的應(yīng)用領(lǐng)域：
1. 蛋白質(zhì)相互作用分析：通過免疫沉淀技術(shù)，研究人員可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，揭示蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成以及它們在細胞內(nèi)的功能和調(diào)控機制。
2. 抗體藥物開發(fā)：免疫沉淀技術(shù)可以用于研究抗體藥物與其靶標(biāo)蛋白的結(jié)合特性，評估抗體藥物的親和力和特異性，指導(dǎo)抗體藥物的設(shè)計和優(yōu)化。
3. 蛋白質(zhì)表達水平分析：通過比較不同條件下的免疫沉淀結(jié)果，可以評估目標(biāo)蛋白的相對量，進而研究蛋白質(zhì)的表達調(diào)控。
4. 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）：這是一種特殊的免疫沉淀技術(shù)，用于研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，如轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾與基因組特定區(qū)域的結(jié)合情況。
5. RNA免疫沉淀（RIP）：類似于ChIP，RIP用于研究RNA結(jié)合蛋白與RNA分子之間的相互作用。

免疫沉淀（ChIP）實驗中抗體的選擇非常關(guān)鍵，因為抗體的特異性和親和力直接影響到實驗的成功與否。
1. 特異性：抗體應(yīng)當(dāng)對目標(biāo)蛋白具有高度的特異性，以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
2. 親和力：抗體對目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高，以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類型：單克隆抗體和多克隆抗體都可以用于IP實驗。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性，而多克隆抗體可能提供更強的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗證：選擇已經(jīng)過免疫沉淀（ChIP）或相關(guān)應(yīng)用（如Western blot, IHC）驗證的抗體，這增加了實驗成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息：選擇信譽良好的抗體供應(yīng)商，并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評價，以幫助做出決策。
免疫沉淀技術(shù)RIP的原理是什么？

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免疫共沉淀分析（Co-IP）與IP十分類似，基本的技術(shù)都是采用目標(biāo)抗原特異性的固相化抗體；但IP的目標(biāo)是純化單一抗原，而Co-IP旨在分離抗原及與抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)或配體。

在Co-IP實驗中，已知抗原稱為誘餌蛋白，與之結(jié)合的蛋白則稱為靶蛋白。靶蛋白可能是一些復(fù)雜的伴侶蛋白、信號分子、結(jié)構(gòu)蛋白、輔助因子等，蛋白間相互作用強度范圍可能介于高度瞬時和十分穩(wěn)定之間。
基本的Co-IP實驗方案與IP相同，實際上任何IP系統(tǒng)均可用于Co-IP。但是，還有許多其他因素需要考慮，例如，結(jié)合和洗滌條件的優(yōu)化，優(yōu)化時，需要考慮到誘餌蛋白-靶蛋白的相互作用強度以及抗體-誘餌蛋白的親和力。
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免疫沉淀技術(shù)ChIP的原理是什么？北京RIP免疫沉淀磁珠多少錢

真核生物的基因組 DNA 以染色質(zhì)（Chromatin）的形式存在。因此，研究蛋白質(zhì)與 DNA 在染色質(zhì)環(huán)境中的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑，而染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatinimmunoprecipitation，ChIP）技術(shù)是目前公認的研究此相互作用的選擇，是真核生物基因表達機制研究中不可或缺的技術(shù)之一。
它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下，固定蛋白質(zhì)-DNA（染色質(zhì)）復(fù)合物，并將其切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法（抗體親和）沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA，通過對目的片段的純化與后期檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。
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標(biāo)簽： 支原體 免疫沉淀