免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)復(fù)合物組成以及特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
基本原理
免疫沉淀技術(shù)基于抗體與特定蛋白質(zhì)(抗原)之間的特異性相互作用。通過(guò)使用針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體,可以從含有多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜樣本中捕獲并富集目標(biāo)蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)有多種類型,包括:
1. 個(gè)別免疫沉淀法(Individual IP)
2. 免疫共沉淀法(Co-IP)
3. 染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)
4. RNA免疫沉淀法(RIP)
近年來(lái),免疫沉淀技術(shù)在固相支持物的選擇上有了很大進(jìn)步。磁性微珠因其操作簡(jiǎn)便、快速和自動(dòng)化程度高而逐漸取代了傳統(tǒng)的瓊脂糖樹(shù)脂。
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ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)實(shí)驗(yàn)是一種用于研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。以下是ChIP實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)概述:
1. 目標(biāo)蛋白的選擇:確定您想要研究的目標(biāo)蛋白,例如特定的轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾。
2. 樣本的準(zhǔn)備:根據(jù)研究的需要選擇合適的細(xì)胞或組織樣本。
3. 抗體的選擇:選擇具有高特異性和親和力的抗體,這對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。
4. 交聯(lián):使用甲醛等交聯(lián)劑將蛋白質(zhì)與DNA在體內(nèi)共價(jià)結(jié)合,形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。
5. 細(xì)胞裂解:裂解細(xì)胞以釋放染色質(zhì),同時(shí)保持蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的完整性。
6. 染色質(zhì)的剪切:通過(guò)超聲或酶消化將染色質(zhì)剪切成適當(dāng)大小的片段,通常在200-1000 bp之間。
7. 免疫沉淀:使用特定抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,然后利用蛋白A/G磁珠沉淀復(fù)合物。
8. 洗滌和洗脫:洗滌沉淀物以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和DNA,然后洗脫目標(biāo)蛋白-DNA復(fù)合物。
9. 逆轉(zhuǎn)交聯(lián):使用蛋白酶K處理樣品以逆轉(zhuǎn)交聯(lián),釋放DNA。
10. DNA的純化和分析:純化DNA并使用qPCR、芯片或測(cè)序技術(shù)(如ChIP-seq)進(jìn)行分析。
深圳RIP免疫沉淀磁珠哪個(gè)公司好用免疫沉淀技術(shù)RIP的實(shí)驗(yàn)方法。
Co-IP的實(shí)驗(yàn)步驟:
1. 細(xì)胞裂解:首先,細(xì)胞或組織被裂解,釋放其中的蛋白質(zhì)。
2. 抗體結(jié)合:然后,將特異性抗體(針對(duì)已知蛋白質(zhì)之一的抗體)加入到裂解物中。這些抗體會(huì)特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白(誘餌蛋白)上。
3. 免疫復(fù)合物形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后,形成免疫復(fù)合物。
4. 沉淀:接著,使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子(如瓊脂糖或磁性珠子)來(lái)捕獲免疫復(fù)合物。蛋白A或蛋白G能夠與抗體的Fc部分結(jié)合,從而拉下抗體以及與之結(jié)合的目標(biāo)蛋白和任何相關(guān)的相互作用蛋白。
5. 洗滌:捕獲的免疫復(fù)合物被洗滌以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
6. 洗脫和分析:免疫復(fù)合物被洗脫并進(jìn)行進(jìn)一步的分析,如Western blot(WB)或質(zhì)譜分析,以鑒定相互作用的蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation, IP)是一種利用抗體與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的特性,從復(fù)雜樣本中分離和純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法。這項(xiàng)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景,以下是一些主要的應(yīng)用領(lǐng)域:
1. 蛋白質(zhì)相互作用分析:通過(guò)免疫沉淀技術(shù),研究人員可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,揭示蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成以及它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的功能和調(diào)控機(jī)制。
2. 抗體藥物開(kāi)發(fā):免疫沉淀技術(shù)可以用于研究抗體藥物與其靶標(biāo)蛋白的結(jié)合特性,評(píng)估抗體藥物的親和力和特異性,指導(dǎo)抗體藥物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化。
3. 蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析:通過(guò)比較不同條件下的免疫沉淀結(jié)果,可以評(píng)估目標(biāo)蛋白的相對(duì)量,進(jìn)而研究蛋白質(zhì)的表達(dá)調(diào)控。
4. 染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP):這是一種特殊的免疫沉淀技術(shù),用于研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用,如轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾與基因組特定區(qū)域的結(jié)合情況。
5. RNA免疫沉淀(RIP):類似于ChIP,RIP用于研究RNA結(jié)合蛋白與RNA分子之間的相互作用。
免疫沉淀技術(shù)RIP是什么?
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)步驟:
1. 樣品制備
a. 懸浮細(xì)胞樣品處理:離心收集細(xì)胞(4℃, 1000g, 5 min),用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液(裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail,使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×)。混勻后置于冰上處理10 min;離心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上備用(或置于-20℃長(zhǎng)期保存)。
b. 貼壁細(xì)胞樣品處理:移去培養(yǎng)基,用PBS清洗細(xì)胞兩遍;用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞,收集至1.5mL EP管內(nèi),按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液(裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail,使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×)。吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞充分接觸。混勻后置于冰上處理10 min;離心收集上清液(4℃, 14000g, 10 min),置于冰上備用(或置于-20℃長(zhǎng)期保存)。
4. 后續(xù):磁珠預(yù)處理——抗體吸附——抗原結(jié)合反應(yīng)——抗體洗脫
免疫沉淀RIP技術(shù)選瓊脂糖珠還是磁珠?北京免疫沉淀磁珠現(xiàn)貨
免疫沉淀技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)?溫州Protein AG免疫沉淀外包公司
免疫沉淀技術(shù)RIP(RNA Immunoprecipitation,RNA免疫沉淀)的實(shí)驗(yàn)方法基于以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟:
1. 細(xì)胞裂解:首先,細(xì)胞或組織樣本被裂解,以釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和RNA復(fù)合物。
2.抗體特異性結(jié)合:裂解后的樣本中加入針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白的抗體。這些抗體能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)蛋白。
3. 免疫復(fù)合物形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后,形成抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
4. 親和介質(zhì)捕獲:使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子(如瓊脂糖或磁性珠子)來(lái)捕獲這些抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。蛋白A或蛋白G能夠與抗體的Fc部分結(jié)合,從而拉下與之結(jié)合的復(fù)合物。
5. 洗滌:捕獲的復(fù)合物被洗滌以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
6. RNA分離和分析:從珠子上洗脫或消化復(fù)合物,分離出RNA,并進(jìn)行進(jìn)一步的分析,如qPCR、Northern blot或高通量測(cè)序(RNA-Seq)。
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