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來源： 發(fā)布時間：2024-08-06

免疫沉淀技術(shù)在探索蛋白質(zhì)的功能方面猶如一把精密的鑰匙，為我們開啟了深入理解生命奧秘的大門。蛋白質(zhì)是生命活動的主要執(zhí)行者，其功能的實(shí)現(xiàn)往往依賴于與其他分子的相互作用。免疫沉淀技術(shù)能夠特異性地捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì)及其相關(guān)復(fù)合物，從而為研究蛋白質(zhì)的功能提供直接的證據(jù)。通過對免疫沉淀得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，可以了解蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、修飾狀態(tài)以及與其他蛋白質(zhì)或核酸的結(jié)合情況。例如，若要研究某一特定轉(zhuǎn)錄因子的功能，可以利用針對該轉(zhuǎn)錄因子的抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后檢測與其結(jié)合的DNA片段，從而確定其調(diào)控的靶基因。此外，免疫沉淀技術(shù)還可用于研究蛋白質(zhì)在不同生理或病理?xiàng)l件下的變化。比較正常細(xì)胞和病變細(xì)胞中特定蛋白質(zhì)的免疫沉淀結(jié)果，能夠發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用的差異，進(jìn)而揭示疾病發(fā)生的分子機(jī)制。在藥物研發(fā)中，免疫沉淀技術(shù)也發(fā)揮著重要作用。它可以幫助篩選與藥物靶點(diǎn)相互作用的蛋白質(zhì)，為藥物的設(shè)計和優(yōu)化提供有價值的信息。免疫沉淀技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法。杭州Protein AG免疫沉淀磁珠多少錢

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免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵，因?yàn)榭贵w的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗(yàn)的成功與否。
1. 特異性：抗體應(yīng)當(dāng)對目標(biāo)蛋白具有高度的特異性，以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
2. 親和力：抗體對目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高，以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類型：單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性，而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗(yàn)證：選擇已經(jīng)過驗(yàn)證的抗體，這增加了實(shí)驗(yàn)成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息：選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商，并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評價，以幫助做出決策。
南京蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)原理免疫沉淀Co-IP抗體的選擇？

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免疫沉淀實(shí)驗(yàn)不同于WB實(shí)驗(yàn)的樣品制備，對實(shí)驗(yàn)樣品制備要求更高，除了要控制所有操作盡量在冰上完成外，關(guān)鍵的是裂解液的成分，裂解液成分直接決定了樣品質(zhì)量。
主要影響：
1. 蛋白的釋放：許多目的蛋白定位在細(xì)胞器，質(zhì)膜，細(xì)胞核，細(xì)胞骨架中，但通常這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)很難被裂解液有效溶解，所以很難將這些蛋白釋放出來。
2. 蛋白相互作用：不同去垢劑對不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)間相互作用影響程度不同，一些互作較弱的蛋白對盡管在比較溫和的裂解液配方中仍然會被破壞。

免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu)  (直徑 50-150 μm)  可以結(jié)合抗體  (繼而結(jié)合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體，而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu)，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸，具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡而言之，瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng)，而磁珠在得率，可重復(fù)性以及自動化方面有明顯的優(yōu)勢。
免疫沉淀技術(shù)RIP的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？

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RIP實(shí)驗(yàn)步驟通常包括：
1. 細(xì)胞收集與交聯(lián)：培養(yǎng)細(xì)胞至適當(dāng)密度。使用交聯(lián)劑（如甲醛）進(jìn)行交聯(lián)，以固定蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
2. 細(xì)胞裂解：收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解，釋放RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在裂解過程中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解。
3. 超聲處理：使用超聲波破壞細(xì)胞，獲得更小的染色質(zhì)片段，這有助于后續(xù)步驟中抗體的接觸。
4. 除去細(xì)胞碎片：通過離心去除細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞，收集含RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的上清液。
5. 免疫沉淀：將針對特定RNA結(jié)合蛋白（RBP）的抗體加入到上清液中。孵育一段時間，使抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合。
6. 捕獲免疫復(fù)合物：添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的磁珠或瓊脂糖珠。孵育使抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物與珠子結(jié)合。
7. 洗滌：多次洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
8. 洗脫與逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫免疫復(fù)合物。使用蛋白酶K處理樣品以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，釋放RNA。
9. RNA提取與純化：從免疫沉淀樣品中提取RNA，并進(jìn)行純化。
10. RNA分析：使用qPCR、Northern blot、RNA-Seq等方法分析沉淀的RNA，以確定與目標(biāo)蛋白相互作用的RNA種類。
免疫沉淀抗體的選擇？南京蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)原理

免疫沉淀技術(shù)RIP實(shí)驗(yàn)步驟。杭州Protein AG免疫沉淀磁珠多少錢

ChIP（染色質(zhì)免疫沉淀）實(shí)驗(yàn)是一種用于研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。以下是ChIP實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法概述：
1. 交聯(lián)：將細(xì)胞與交聯(lián)劑（如1%甲醛）孵育，通常在室溫下進(jìn)行10-15分鐘。
2. 終止交聯(lián)：添加甘氨酸以終止交聯(lián)反應(yīng)，孵育5分鐘。
3. 收集細(xì)胞：通過離心收集細(xì)胞，并用PBS洗滌以去除交聯(lián)劑。
4. 細(xì)胞裂解：使用裂解緩沖液裂解細(xì)胞，釋放染色質(zhì)。
5. 染色質(zhì)剪切：使用超聲波或酶消化將染色質(zhì)剪切成適當(dāng)大小的片段。
6. 免疫沉淀：將剪切后的染色質(zhì)與特異性抗體孵育，然后添加蛋白A/G磁珠。
7. 洗滌：用低鹽、高鹽和LiCl洗滌液洗滌磁珠，去除非特異性結(jié)合物。
8. 洗脫：用洗脫緩沖液洗脫DNA。
9. 逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：用蛋白酶K處理，然后在65°C下加熱過夜以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)。
10. DNA純化：使用商業(yè)試劑盒或標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿方法純化DNA。
11. 分析：使用qPCR分析富集的DNA，或進(jìn)行測序以確定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。
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標(biāo)簽： 免疫沉淀 支原體