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米開羅那(東莞)工業(yè)智能科技有限公司在香港城市大學(xué)-復(fù)旦大學(xué)
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如何提高細胞轉(zhuǎn)染效率:1.組織培養(yǎng)試劑優(yōu)化細胞生長條件。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑,并經(jīng)可能減少所用試劑的變更?;A(chǔ)培養(yǎng)基—目前所使用的各種市售培養(yǎng)基(如,RPMI 1640和DMEM)。培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸,葡萄糖),維生素,無機鹽,和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定,因此如果不在使用時新鮮加入就可能會產(chǎn)生問題。務(wù)必要使培養(yǎng)基避光保存。因為已知有一些組分和緩沖物質(zhì),如HEPES,當(dāng)暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)。另外,血清,添加劑,來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì),或/細胞的污染也都可能影響到細胞生理。2.細胞生長狀態(tài)密切觀察您的細胞;確保它們狀態(tài)良好。在開始轉(zhuǎn)染細胞之前,先制定一個適當(dāng)?shù)姆N板方案,使細胞密度從轉(zhuǎn)染開始到結(jié)束都保持較佳狀態(tài)。增加成功幾率—細胞是轉(zhuǎn)染過程中的一個關(guān)鍵元素,它可以是影響結(jié)果的一致性和質(zhì)量的較重要的變量。一般的瞬時轉(zhuǎn)染 方法多采用脂質(zhì)體法。開封正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑價格
細胞轉(zhuǎn)染:(1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備A.將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩,。(2)選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體體積:DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。(3)將混合液在室溫放置10—15分鐘。(4)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。(5)加入混合液,將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。(6)到時后,根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。合肥細胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪里買細胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應(yīng)用而異。
轉(zhuǎn)染的注意事項:用于蛋白生產(chǎn)的細胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無血清培養(yǎng)基中進行。但更傾向于使用無血清培養(yǎng)基表達蛋白,因為血清蛋白會干擾下游表達蛋白的純化。無血清培養(yǎng)基一般針對某一特定細胞類型優(yōu)化并有幾類無血清培養(yǎng)基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添加血清的培養(yǎng)基低得多)。無蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物,限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇較適合您應(yīng)用的一種。在含血清時轉(zhuǎn)染的細胞可以適應(yīng)無血清培養(yǎng)基,無蛋白培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基。在部分情況下(如293-F,293-H,COS-7和CHO-S),對于已適應(yīng)無血清或無蛋白培養(yǎng)基的細胞,可以使用其培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)染。其他一些無血清培養(yǎng)基包含克制陰離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的成分,在這些情況下,有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。
細胞轉(zhuǎn)染的注意事項:物品(PS)物品,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,ICIN選擇性物品的競爭性克制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量。大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康。
細胞轉(zhuǎn)染方法:1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用,將DNA分子包裹入內(nèi),形成DNA脂復(fù)合物,也能被表面帶負電的細胞膜吸附,再通過融合或細胞內(nèi)吞進入細胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,是目前實驗室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一,其轉(zhuǎn)染率較高,優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細胞有一定的毒性,所以轉(zhuǎn)染時間一般不超過24小時。常用細胞類型:cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等2.電穿孔轉(zhuǎn)染法電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使DNA分子進入胞內(nèi),這種方法就是電穿孔。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下,高電場強度會殺死50%-70% 的細胞?,F(xiàn)在針對細胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護劑,可以較大的降低細胞的死亡率,同時提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率。有血清時的轉(zhuǎn)染 血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率。開封正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑價格
可以使用一些營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基,或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。開封正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑價格
細胞轉(zhuǎn)染的注意事項:1.細胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細胞有毒害作用,細胞太少,容易死。一般轉(zhuǎn)染時,貼壁細胞密度為70%-90%,懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml,確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細胞密度很敏感,所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。細胞的融合度必須要達到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子,如SV40和RSV(勞斯肉瘤細菌)相比,在BHK-21中其活性較高。這三種細菌啟動子在T細胞來源的細胞系,如Jurkat中組成表達水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細胞中CMV啟動子,而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子。SV40啟動子的表達在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時會提高,因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。開封正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑價格