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細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用步驟:1.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體體積:DNA質(zhì)量)來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。5.加入混合液,將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。6.到時(shí)后,根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞不匹配細(xì)胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細(xì)胞。青島正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家
細(xì)胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清:不同的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染試劑要求轉(zhuǎn)染的條件是不同的。較好是在靠前次實(shí)驗(yàn)前做一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn),比如:HeLa,293,CHO,COS7,MCF-7,HepG2等細(xì)胞,是否加血清,對(duì)不同的細(xì)胞是有不同的影響的,有些細(xì)胞是可以有血清的,有些加血清就會(huì)受影響。轉(zhuǎn)染后在6小時(shí)左右較好換液且換為有血清的培養(yǎng)基,其一因?yàn)槠胀ㄞD(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性作用大,其二可降低因血清的缺乏引起的細(xì)胞的死亡。轉(zhuǎn)染時(shí)不加血清是防止血清的干擾作用,轉(zhuǎn)染后可適時(shí)加入。加入過(guò)早會(huì)引起未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng),過(guò)晚會(huì)引起較多細(xì)胞死亡??蓪?shí)時(shí)觀察1/5細(xì)胞變圓的時(shí)候加入血清。徐州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。
如何高效率實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑,以其適用宿主范圍廣,操作簡(jiǎn)便,對(duì)細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。脂質(zhì)體(liposome)是一種人工膜,在水相中形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的球形封閉囊泡。脂質(zhì)體可以和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后重新形成復(fù)合物,當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí),通過(guò)內(nèi)吞作用形成內(nèi)體(endosomes)進(jìn)入細(xì)胞,通過(guò)緩沖液的作用以及脂質(zhì)與內(nèi)體膜融合,增大內(nèi)體的內(nèi)部滲透壓,使內(nèi)體結(jié)構(gòu)破壞,釋放出核酸。隨后DNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。對(duì)于普通細(xì)胞系,一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法較重要的就是防止其毒性,因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例,細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素,通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化合適的轉(zhuǎn)染條件對(duì)于轉(zhuǎn)染效率的提高很重要。
細(xì)胞電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的幾點(diǎn)建議:1.電場(chǎng)強(qiáng)度要合適合適的電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)于電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)非常重要,電場(chǎng)強(qiáng)度不能過(guò)高,過(guò)高會(huì)增加細(xì)胞的死亡率;也不能過(guò)低,過(guò)低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細(xì)胞系具有不同的較佳場(chǎng)強(qiáng)值,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)測(cè)定所轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的較佳電場(chǎng)強(qiáng)度。2.細(xì)胞狀態(tài)要好用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(15代以內(nèi),傳代后2d)。因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分裂旺盛,表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差,電轉(zhuǎn)后,細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng),而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA.細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法:人工脂質(zhì)體法原理:帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物,進(jìn)而可被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染/瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染。這種方法幾乎適用于所有細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率高、重復(fù)型好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需要去除血清,轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大。實(shí)驗(yàn)步驟:在單獨(dú)試管中分別稀釋核酸及轉(zhuǎn)染試劑→脂質(zhì)體與核酸的磷酸骨架結(jié)合,形成復(fù)合物→脂質(zhì)體上的正電荷有助于復(fù)合物與細(xì)胞膜結(jié)合→復(fù)合物通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿→分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或沉默情況。重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,較好在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液。蘇州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑供應(yīng)商
形成DNA脂復(fù)合物,也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附。青島正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家
細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的方法有哪些:1..電穿孔法。通過(guò)短暫的高電場(chǎng)電脈沖處理細(xì)胞,沿細(xì)胞膜的電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的暫時(shí)穿孔。DNA被認(rèn)為是穿過(guò)孔擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要,因?yàn)檫^(guò)高的場(chǎng)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。理論上說(shuō)電穿孔法可用于各種細(xì)胞,且不需要另外采購(gòu)特殊試劑,但需要昂貴的電轉(zhuǎn)儀。此法每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA,因?yàn)榧?xì)胞的死亡率高。每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化。2.細(xì)菌介導(dǎo)的傳染。傳染需要將目的基因克隆到特定的細(xì)菌體系中,經(jīng)過(guò)包裝細(xì)胞的包裝得到改造后的細(xì)菌,再進(jìn)行傳染。優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率特別高,尤其是難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、細(xì)胞。缺點(diǎn)是構(gòu)建細(xì)菌周期長(zhǎng),環(huán)節(jié)多,易出錯(cuò),費(fèi)用也高。青島正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家