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來源: 發(fā)布時間:2021-11-11

細胞轉染的常用方法:細菌轉染:原理:對于用脂質體不能實現(xiàn)轉染的細胞,可以采用細菌轉染??捎糜诘鞍踪|過表達或克制,是臨床研究中較常用的方法。它通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中,可用于難轉染細胞、原代細胞的穩(wěn)定性轉染。實驗步驟:通過基因克隆生成重組細菌 → 采用非細菌法轉染包裝細胞系,擴增并分離得到重組細菌顆?!兓⒌味毦骸D導目的細胞(含有細菌特異性的受體)→去除培養(yǎng)物中的細菌,并加入新鮮培養(yǎng)基→分析細胞瞬時基因表達或沉默情況。瞬時和穩(wěn)定表達DNA轉染后,轉入基因的表達可以在1-4天內檢測到。北京細胞高效轉染試劑廠家供應

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影響轉染試驗的因素:細胞狀態(tài)變化:(1)轉染試劑與細胞不匹配細胞轉染較適合的不是原代細胞,也不是傳代很多次的細胞。這是因為細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,總染色體重組或基因調控變化等而演化。這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。較適合轉染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到對數(shù)生長期的細胞,細胞生長旺盛,較容易轉染。(2)把握時機沒錯!轉染也有適當?shù)臅r機,相比較非分裂細胞——分裂細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA。因此對大多數(shù)轉染操作而言,細胞都在轉染當天或前現(xiàn)在種板。同樣重要的是細胞在種板進行轉染時不應處于過度生長的狀態(tài),如細胞數(shù)量過多,互相疊加,營養(yǎng)物質耗竭,代謝廢物積聚,轉染率低下也是很正常的!溫州細胞高效轉染試劑廠家現(xiàn)貨對于貼壁細胞,一般要求在轉染前一日,用胰酶處理為單細胞懸液。

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細胞轉染的常用方法:人工脂質體法 原理:帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物,進而可被細胞內吞穩(wěn)定轉染/瞬時性轉染。這種方法幾乎適用于所有細胞,轉染效率高、重復型好,但轉染時需要去除血清,轉染效果隨細胞類型變化大。實驗步驟:在單獨試管中分別稀釋核酸及轉染試劑 → 脂質體與核酸的磷酸骨架結合,形成復合物 → 脂質體上的正電荷有助于復合物與細胞膜結合 → 復合物通過內吞作用進入胞漿 → 分析細胞瞬時基因表達或沉默情況。

細胞電轉染實驗的幾點建議:1. 電場強度要合適合適的電場強度對于電轉染實驗非常重要,電場強度不能過高,過高會增加細胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細胞系具有不同的較佳場強值,實驗前應測定所轉染細胞系的較佳電場強度。2. 細胞狀態(tài)要好用于電轉的細胞一般選取處于對數(shù)生長期的細胞(15代以內,傳代后2d)。因為處于對數(shù)生長期的細胞分裂旺盛,表面結構致密比穩(wěn)定期的細胞差,電轉后,細胞膜的恢復能力強,而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA.脂質體轉染法陽離子脂質體表面帶正電荷。

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細胞轉染的注意事項:血清A、DNA-陽離子脂質體復合物形成時不能含血清,因為血清會影響復合物的形成。B、一般細胞對無血清培養(yǎng)可以耐受幾個小時沒問題,轉染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加,但血清一度曾被認為會降低轉染效率,轉染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進行優(yōu)化。C、對于對血清缺乏比較敏感的細胞,可以使用營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基,或者在轉染培養(yǎng)基中使用血清。對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞,建議使用**轉染試劑。有條件的話,可以用無血清培養(yǎng)基代替PBS洗細胞兩遍,注意洗的時候要輕,靠邊緣緩緩加入液體,然后不要吹吸細胞而是轉動培養(yǎng)板讓液體滾動在細胞表面。如果洗的太厲害,細胞又損失一部分,加了脂質體后,細胞受影響就更大了,死亡細胞會增多。大部分外源DNA會被核酸酶降解或隨細胞分裂而稀釋。廈門昆明細胞高效轉染試劑

較適合轉染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到對數(shù)生長期的細胞。北京細胞高效轉染試劑廠家供應

細胞轉染效率低下的幾個大坑:1.試劑過期有時候轉染效率低下,還要考慮會不會存在試劑過期的情況。毛博當年做轉染整整半年,百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn),原來是Lipofectamine 2000過期了。換了之后,立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗,盡量使用開封半年內的,因為過了半年后,就算沒有過失效期,但是細胞毒性較大增加,而轉染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢,影響實驗進度哈。2.未加血清轉染后未及時加入血清,會導致細胞大量死亡。一般要在轉染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗,其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候,較好不要換液,不要打擾細胞,讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話,會引起未轉染的細胞瘋狂生長。那么,什么是較佳時機呢?在20%的細胞變圓的時候,就是加血清的較佳時機。北京細胞高效轉染試劑廠家供應

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原代細胞(primary culture cell)是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞。有人把培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。原代細胞不僅廣泛應用于分子、細胞生物學和生物醫(yī)學基礎研究,如蛋白質組學、基因組學、細胞株(系)研究、DNA,RNA和遺傳學研究等,還可應用于當今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、**藥物的研究等。原代細胞在生物醫(yī)藥領域有不可替代性作用,市場前景廣闊。