如何高效率實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:DNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞胞漿內(nèi)的DNA 不能穿過細(xì)胞核的核膜("核屏障")。在細(xì)胞有絲分裂過程中核膜溶解,DNA進(jìn)入細(xì)胞核才有可能。為此,細(xì)胞處于分裂期對(duì)DNA轉(zhuǎn)染是至關(guān)重要的,并且處于分裂期的細(xì)胞比例必須盡可能大才能實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。DNA轉(zhuǎn)染機(jī)制示意圖如下所示:轉(zhuǎn)染RNA(siRNA/miRNA/mRNA)對(duì)于RNA轉(zhuǎn)染是沒有"核屏障"的,因?yàn)镽NA不需要進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng),因此細(xì)胞分裂對(duì)它沒有影響。轉(zhuǎn)染試劑的選擇理想的轉(zhuǎn)染試劑選擇可以使您的實(shí)驗(yàn)如虎添翼!真核細(xì)胞的先天免疫系統(tǒng),使它們能夠檢測(cè)外來物質(zhì)如脂多糖、細(xì)菌或細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì),并克制潛在病原體的入侵。此外,細(xì)胞通過信使分子向臨近細(xì)胞傳遞發(fā)現(xiàn)有害物質(zhì)的信號(hào)。因此,這些臨近細(xì)胞甚至無需接觸病原體即可采取防御方式。這種細(xì)胞先天免疫系統(tǒng)也是轉(zhuǎn)染成功的一個(gè)障礙。瞬時(shí)表達(dá)分析檢測(cè)未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達(dá)。金華開封細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑
細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):細(xì)胞狀態(tài)這點(diǎn)非常重要,不要急于求成,一定要讓細(xì)胞處于較佳的生長(zhǎng)狀態(tài)再做。有文獻(xiàn)說傳代不要超過17代。細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右時(shí)細(xì)胞狀態(tài)較好,不要用傳了很多代的細(xì)胞去做,細(xì)胞的形態(tài)都會(huì)發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)較佳結(jié)果。或者,幾種來源于經(jīng)篩選,轉(zhuǎn)染效率較高細(xì)胞亞系的細(xì)胞系現(xiàn)在有售。正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家建議選擇50%~80%區(qū)間密度進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法:1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用,將DNA分子包裹入內(nèi),形成DNA脂復(fù)合物,也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附,再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前實(shí)驗(yàn)室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一,其轉(zhuǎn)染率較高,優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞有一定的毒性,所以轉(zhuǎn)染時(shí)間一般不超過24小時(shí)。常用細(xì)胞類型:cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等2.電穿孔轉(zhuǎn)染法電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的水通路或膜上小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi),這種方法就是電穿孔。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時(shí)建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下,高電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)殺死50%-70% 的細(xì)胞?,F(xiàn)在針對(duì)細(xì)胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑,可以較大的降低細(xì)胞的死亡率,同時(shí)提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑:1.試劑過期有時(shí)候轉(zhuǎn)染效率低下,還要考慮會(huì)不會(huì)存在試劑過期的情況。毛博當(dāng)年做轉(zhuǎn)染整整半年,百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn),原來是Lipofectamine 2000過期了。換了之后,立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn),盡量使用開封半年內(nèi)的,因?yàn)檫^了半年后,就算沒有過失效期,但是細(xì)胞毒性較大增加,而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢,影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度哈。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時(shí)加入血清,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時(shí)換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗(yàn),其實(shí)也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個(gè)時(shí)候,較好不要換液,不要打擾細(xì)胞,讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話,會(huì)引起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瘋狂生長(zhǎng)。那么,什么是較佳時(shí)機(jī)呢?在20%的細(xì)胞變圓的時(shí)候,就是加血清的較佳時(shí)機(jī)。瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)DNA轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1-4天內(nèi)檢測(cè)到。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選:生長(zhǎng)的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN物品的影響。轉(zhuǎn)染后,在開始篩選前等待48-72小時(shí),使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶,保證在開始篩選時(shí)可以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)倒掉培養(yǎng)基,加入含有GENETICIN物品的培養(yǎng)基,物品的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定,足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因?yàn)樵S多因子影響到篩選所需的GENETICIN物品的較佳濃度,包括細(xì)胞類型,培養(yǎng)基和血清濃度等,所以有必要對(duì)每種細(xì)胞作一個(gè)劑量反應(yīng)曲線,確定較佳濃度。篩選較多可能需要一周時(shí)間,因?yàn)樵谥滤绖┝康腉ENETICIN物品存在條件下,細(xì)胞會(huì)分裂1-2次。在次培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用較低劑量的物品,一般是篩選劑量的一半。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?,可以分別純化(克?。?,收集進(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計(jì)數(shù)。一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 方法多采用脂質(zhì)體法。徐州正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑平均價(jià)格
脂質(zhì)體可以和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后重新形成復(fù)合物。金華開封細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑
細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介:實(shí)驗(yàn)材料與器材:1、材料293T細(xì)胞、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸鹽緩沖溶液)、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑(TransFast)2、器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈、廢液缸、血球計(jì)數(shù)板、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺(tái)式離心機(jī)、35mm培養(yǎng)皿、轉(zhuǎn)染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 法較重要的就是防止其毒性,因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例,細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題,通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。金華開封細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑