目前,世界各國(guó)的腦科學(xué)研究如火如荼,中國(guó)的腦計(jì)劃也即將啟動(dòng)。其中,關(guān)于全景式解析腦連接圖譜和功能動(dòng)態(tài)圖譜的研究成為重點(diǎn)研究方向,而如何打破尺度壁壘,融合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)與大腦整體的信息處理和個(gè)體行為信息,是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。2021年1月6日,由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭,聯(lián)合北大信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院電子學(xué)系、工學(xué)院以及中國(guó)人民******醫(yī)學(xué)科學(xué)院等組成的跨學(xué)科團(tuán)隊(duì),在NatureMethods在線發(fā)表題為“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章。文中報(bào)道了第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0,其成像視野是該團(tuán)隊(duì)于2017年發(fā)布的低1代微型化顯微鏡的7.8倍,同時(shí)具備三維成像能力,獲取了小鼠在自由運(yùn)動(dòng)行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個(gè)神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)功能圖像,并且實(shí)現(xiàn)了針對(duì)同一批神經(jīng)元長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月的追蹤記錄。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。investigator雙光子顯微鏡成像視野
雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西,冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子,而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢(shì)呢?它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎?原來(lái),雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、觀察!由于電磁波的波長(zhǎng)越短,粒子性越強(qiáng),受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長(zhǎng)波長(zhǎng)激光,在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對(duì)細(xì)胞的毒性。除此之外,因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng),所以掃描的精確度極高,也能提高激發(fā)光效率,減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗。進(jìn)口bruker雙光子顯微鏡光刺激由于雙光子顯微鏡使用的是可見(jiàn)光或近紅外光作為激發(fā)光源,適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究。
雙光子顯微鏡的應(yīng)用由于適合動(dòng)態(tài)成像,雙光子顯微鏡一經(jīng)問(wèn)世便很快應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、遺傳發(fā)育、藥物代謝等領(lǐng)域。雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對(duì)***神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分子相互作用等進(jìn)行直接成像監(jiān)測(cè),而且能夠進(jìn)行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱。同時(shí),雙光子顯微鏡能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)**在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,并可對(duì)**治療過(guò)程中*細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估。隨著光學(xué)技術(shù)、熒光探針技術(shù)、計(jì)算機(jī)成像技術(shù)的發(fā)展,雙光子顯微技術(shù)會(huì)得到更大提升和更廣的應(yīng)用,未來(lái)不僅用于基礎(chǔ)研究,也將擴(kuò)展到臨床應(yīng)用。
隨著技術(shù)的發(fā)展,雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,結(jié)合它的特點(diǎn),大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,大致可從兩個(gè)方面入手,裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,我們可以把激光束變得更細(xì),使能量更加集中,就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,解決這個(gè)問(wèn)題,我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來(lái)的高能量容易損傷細(xì)胞,所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬(wàn)億分之一秒,而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫,這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,又能不損傷細(xì)胞,使掃描能更好地進(jìn)行。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。
利用鈣成像技術(shù)記錄大腦活動(dòng),隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展,神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一,其主要原理是將外源性熒光信號(hào)和生理現(xiàn)象耦合起來(lái)——通過(guò)熒光染料信號(hào)的改變反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度,以此細(xì)胞的功能狀態(tài)。目前它被廣泛應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化,從而判斷其功能活動(dòng)。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號(hào)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時(shí)間和空間上的傳遞穿梭。雙光子顯微鏡的原理是什么?國(guó)內(nèi)ultima雙光子顯微鏡光毒性
雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像。investigator雙光子顯微鏡成像視野
從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn):☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見(jiàn)光或近紅外光作為激發(fā)光源,這一波段的光對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小,適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究;☆穿透能力強(qiáng):相對(duì)于紫外光,可見(jiàn)光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,因而受生物組織散射的影響更小,解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問(wèn)題;☆高分辨率:由于雙光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi);☆漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處,所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象;☆熒光收集率高:與共聚焦成像相比,雙光子成像不需要光學(xué)濾波器(共焦),這樣就提高了對(duì)熒光的收集率,而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高;☆圖像對(duì)比度高:由于熒光波長(zhǎng)小于入射波長(zhǎng),因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16,降低了散射的干擾;☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性,所以可以對(duì)生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究;investigator雙光子顯微鏡成像視野