單光子顯微技術(shù)是*成熟的熒光顯微技術(shù),但由于單光子顯微技術(shù)使用的激發(fā)光波長較短,成像深度比較有限;能量比較大,會造成對熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴(yán)重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現(xiàn)樣本三維成像要逐點掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細(xì)胞成像實驗。而寬場顯微鏡能夠很好地實現(xiàn)實時動態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的實時檢測,但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現(xiàn)多維成像。鈣是模型動物神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使,參與細(xì)胞多種功能的調(diào)節(jié),可以產(chǎn)生多種細(xì)胞內(nèi)信號。江蘇神經(jīng)元鈣成像動物行為學(xué)
現(xiàn)在有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法,且都可以用于體內(nèi)和體外研究。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個神經(jīng)元中。此方法方便實驗者控制單個神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負(fù)載神經(jīng)元,觀察對象為一群神經(jīng)元。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細(xì)胞也被指示劑所標(biāo)記,但提高了整體神經(jīng)元的標(biāo)記百分比,使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動作電位相關(guān)性的活動。第三種也較為常用,通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑。(A)單細(xì)胞注射法;(B)network loading法;(C)通過病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼鈣離子指示劑(expression of genetically encoded calcium indicators, GECI)上海神經(jīng)元鈣成像多少錢對鈣離子的功能研究中,鈣指示劑是必不可少的工具。
不論采用哪一類鈣離子指示劑,總體上成像記錄過程是非常類似的。包含鈣離子指示劑的細(xì)胞可以通過熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)觀測,然后通過CCD攝像機捕捉、記錄圖像?,F(xiàn)在鈣成像技術(shù)主要在以下幾類神經(jīng)科學(xué)研究方面有廣泛應(yīng)用:1.記錄培養(yǎng)的神經(jīng)元的活動。2.記錄腦片上神經(jīng)元的活動。記錄神經(jīng)元的活動。由于離體實驗本身的限制,現(xiàn)在越來越多的神經(jīng)方面科學(xué)家傾向于做在體鈣成像實驗,希望能得到更準(zhǔn)確且更能反應(yīng)生理狀況的數(shù)據(jù)。得益于雙光子熒光顯微鏡的發(fā)展,現(xiàn)在在實驗動物處于huoti狀態(tài)下的鈣成像技術(shù)取得了飛速進(jìn)展。4.記錄神經(jīng)元樹突和樹突棘(spine)的活動。由于對于實驗精度的要求,有些科學(xué)家不僅只想記錄單個神經(jīng)元的反應(yīng),他們還想更確切地知道神經(jīng)元上哪些樹突和樹突棘參與了某個行為,也就是說他們需要在huoti條件下,對單根樹突以及某些spine進(jìn)行鈣成像記錄實驗。由于雙光子熒光顯微鏡和GCaMP6基因編碼鈣離子指示劑的發(fā)展,現(xiàn)在,對樹突和樹突棘用鈣成像實驗進(jìn)行記錄也成為了可能。
對于雙光子(2P)鈣成像而言,離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個*da的深度限制因素,而對于三光子成像這兩個問題大大減小,但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多,所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。功能性三光子顯微鏡比結(jié)構(gòu)性三光子顯微鏡的要求更高,它需要更快速的掃描,以便及時采樣神經(jīng)元活動;需要更高的脈沖能量,以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來,需要同時監(jiān)控非常龐大且分布guangfan的神經(jīng)元的活動,大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激,要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學(xué),就需要MPM具備對神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力??焖費PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)我們的鈣成像系統(tǒng)集成自動控制和精確計時的多模式輸入端口。
單光子顯微技術(shù)是較成熟的熒光顯微技術(shù),但由于其使用的激發(fā)光波長較短,成像深度有限;能量較大,會造成對熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴(yán)重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現(xiàn)樣本三維成像要逐點掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細(xì)胞成像。而寬場顯微鏡能夠很好地實現(xiàn)實時動態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的實時檢測,但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現(xiàn)多維成像。雙光子熒光顯微鏡(Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy)。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學(xué)成像方法,采用長波激發(fā),能對組織進(jìn)行深層次成像。常用的比較好激發(fā)波長大多位于800-900nm,而水、血液和固有組織發(fā)色團(tuán)對這個波段的光吸收率低,此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品,因此背景第,光損傷小,適用于在體檢測。雙光子熒光成像技術(shù)能準(zhǔn)確定位細(xì)胞內(nèi)置入的微電極位置,從而觀察胞體、樹突甚至單個樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細(xì)胞單個樹突棘中的鈣分布。鈣成像系統(tǒng)具有單細(xì)胞分辨率的大視野的特征。深圳在體鈣成像大概費用
鈣成像系統(tǒng)在自由行為動物上對鈣離子動態(tài)進(jìn)行單細(xì)胞分辨率級別的持久成像。江蘇神經(jīng)元鈣成像動物行為學(xué)
想要對鈣離子的動態(tài)變化進(jìn)行有效的檢測,鈣離子指示劑的選擇顯得尤為重要。鈣離子熒光指示劑在未結(jié)合鈣離子前幾乎無熒光,與鈣離子結(jié)合后,熒光強度明顯增強。利用這一原理,可以通過指示劑的信號強弱來觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度水平的變化。根據(jù)激發(fā)光波長范圍,鈣離子指示劑可以分為可見光激發(fā)和紫外光激發(fā),而根據(jù)其工作原理又可以分為比率和非比率型。常見的鈣離子指示劑有,紫外光激發(fā)Ca2+熒光探針、可見光激發(fā)Ca2+熒光探針、轉(zhuǎn)基因Ca2+指示劑。江蘇神經(jīng)元鈣成像動物行為學(xué)
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