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熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率

來源: 發(fā)布時間:2022-09-14

激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束經(jīng)照明,經(jīng)由分光鏡反射至物鏡,并聚焦于樣品上,對標本焦平面上每一點進行掃描。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡,通過探測***時先聚焦,然后被光探頭收集,轉(zhuǎn)化為信號輸送到計算機進行處理。這個裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發(fā)出的熒光,使成像更為清晰準確,同時通過改變物鏡的焦距,能對不同焦平面進行掃描,通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像。雙光子顯微鏡廠家有哪些?熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率

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像差問題一直困擾著光學領(lǐng)域的工作者。像差會使光波前發(fā)生形變,不僅降低成像的信噪比和分辨率,使得很多時候我們只能“霧里看花”,更甚者,產(chǎn)生贗像,或無法獲得有意義的圖像。像差問題對雙光子成像的影響尤為嚴重,因為在那里,熒光信號對入射光強度的依賴是平方關(guān)系,一旦入射光波前形變,不僅聚焦強度大幅下降,成像分辨率也急劇惡化。因此,如何解決像差問題,實現(xiàn),例如小鼠大腦皮層,深層區(qū)域的高質(zhì)量成像成為光學成像發(fā)展中相當有挑戰(zhàn)性的問題之一。熒光激光雙光子顯微鏡授權(quán)商雙光子顯微鏡的探測器,該怎么選用?

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細胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當個細胞興奮時,產(chǎn)生了一個電沖動,此時,細胞外的鈣離子流入該細胞內(nèi),促使該細胞分泌神經(jīng)遞質(zhì),神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細胞膜上的蛋白分子結(jié)合,促使這一級神經(jīng)細胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推,神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去,從而構(gòu)成復雜的信號體系,終形成學習、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中,鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM,而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少。眾所周知,只有游離鈣才具有生物學活性,而細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體(nAChR)和瞬時受體電位C型通道(TRPC)等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來,以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細胞。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出,30年后因為有了激光才得到實驗驗證,但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產(chǎn)生非線性過程,這要求極高的電場強度,而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,脈寬越窄,雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?;谝陨戏治?,能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢:只有焦平面處才能形成雙光子吸收,而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā),所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,而近紅外相比可見光穿透更深,對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡可以進行厚的組織樣品拍攝。

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從雙光子到三光子:科學家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,如果雙光子吸收可行,那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長,大約在1.3和1.7微米,其成像深度也比雙光子更深,目前記錄約為2.2毫米,人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡,三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖,而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求,但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡角膜成像。國外激光雙光子顯微鏡廠家

雙光子顯微鏡的原理是什么?熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率

由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度,在我們的實驗中,時間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制。盡管在單點掃描系統(tǒng)中,v2PE激發(fā)會使得空間分辨率提高,但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率,這主要是多聚焦成像和單點掃描技術(shù)之間的差異造成的。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE,引入圖像掃描技術(shù)可以進一步提高空間分辨率,這種技術(shù)需要通過在陣列前引入額外的微透鏡陣列來實現(xiàn)。除此之外,由于可見光區(qū)域的共振效應(yīng),可能會產(chǎn)生光漂白,因而為了延長觀察時間,系統(tǒng)還需要對激發(fā)強度和曝光時間做進一步優(yōu)化。熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率

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