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熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2022-09-14

激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場(chǎng)光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束經(jīng)照明,經(jīng)由分光鏡反射至物鏡,并聚焦于樣品上,對(duì)標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來(lái)入射光路直接反向回到分光鏡,通過(guò)探測(cè)***時(shí)先聚焦,然后被光探頭收集,轉(zhuǎn)化為信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。這個(gè)裝置能讓通過(guò)探測(cè)***的只有焦平面上發(fā)出的熒光,使成像更為清晰準(zhǔn)確,同時(shí)通過(guò)改變物鏡的焦距,能對(duì)不同焦平面進(jìn)行掃描,通過(guò)計(jì)算機(jī)繪出普通顯微鏡無(wú)法觀測(cè)的三維圖像。雙光子顯微鏡廠家有哪些?熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率

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像差問(wèn)題一直困擾著光學(xué)領(lǐng)域的工作者。像差會(huì)使光波前發(fā)生形變,不僅降低成像的信噪比和分辨率,使得很多時(shí)候我們只能“霧里看花”,更甚者,產(chǎn)生贗像,或無(wú)法獲得有意義的圖像。像差問(wèn)題對(duì)雙光子成像的影響尤為嚴(yán)重,因?yàn)樵谀抢铮瑹晒庑盘?hào)對(duì)入射光強(qiáng)度的依賴是平方關(guān)系,一旦入射光波前形變,不僅聚焦強(qiáng)度大幅下降,成像分辨率也急劇惡化。因此,如何解決像差問(wèn)題,實(shí)現(xiàn),例如小鼠大腦皮層,深層區(qū)域的高質(zhì)量成像成為光學(xué)成像發(fā)展中相當(dāng)有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題之一。熒光激光雙光子顯微鏡授權(quán)商雙光子顯微鏡的探測(cè)器,該怎么選用?

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細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號(hào)分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)個(gè)細(xì)胞興奮時(shí),產(chǎn)生了一個(gè)電沖動(dòng),此時(shí),細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi),促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì),神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合,促使這一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng)。以此類推,神經(jīng)信號(hào)便一級(jí)一級(jí)地傳遞下去,從而構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)體系,終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級(jí)功能。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中,鈣離子同樣扮演著重要的信號(hào)分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM,而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,增加的鈣離子對(duì)于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過(guò)程必不可少。眾所周知,只有游離鈣才具有生物學(xué)活性,而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,同時(shí)也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,其中包括電壓門(mén)控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體(nAChR)和瞬時(shí)受體電位C型通道(TRPC)等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過(guò)熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來(lái),以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時(shí)觀察多個(gè)功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出,30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,首先要了解其中的非線性過(guò)程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程,這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度,而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,脈寬越窄,雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡,聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān),所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?;谝陨戏治?,能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說(shuō)明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì):只有焦平面處才能形成雙光子吸收,而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被激發(fā),所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見(jiàn)光波長(zhǎng))。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì),鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍,而近紅外相比可見(jiàn)光穿透更深,對(duì)生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝。

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從雙光子到三光子:科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,如果雙光子吸收可行,那么三光子看起來(lái)也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng),大約在1.3和1.7微米,其成像深度也比雙光子更深,目前記錄約為2.2毫米,人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡,三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡角膜成像。國(guó)外激光雙光子顯微鏡廠家

雙光子顯微鏡的原理是什么?熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率

由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度,在我們的實(shí)驗(yàn)中,時(shí)間分辨率主要是受OPO輸出可見(jiàn)光激光功率的限制。盡管在單點(diǎn)掃描系統(tǒng)中,v2PE激發(fā)會(huì)使得空間分辨率提高,但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率,這主要是多聚焦成像和單點(diǎn)掃描技術(shù)之間的差異造成的。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE,引入圖像掃描技術(shù)可以進(jìn)一步提高空間分辨率,這種技術(shù)需要通過(guò)在陣列前引入額外的微透鏡陣列來(lái)實(shí)現(xiàn)。除此之外,由于可見(jiàn)光區(qū)域的共振效應(yīng),可能會(huì)產(chǎn)生光漂白,因而為了延長(zhǎng)觀察時(shí)間,系統(tǒng)還需要對(duì)激發(fā)強(qiáng)度和曝光時(shí)間做進(jìn)一步優(yōu)化。熒光激光雙光子顯微鏡最大分辨率

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