高阻封接問題的解決不僅改善了電流記錄性能,還隨之出現了研究通道電流的多種膜片鉗方式。根據不同的研究目的,可制成不同的膜片構型。細胞吸附膜片(cell-attachedpatch)將兩次拉制后經加熱拋光的微管電極置于清潔的細胞膜表面上,形成高阻封接,在細胞膜表面隔離出一小片膜,既而通過微管電極對膜片進行電壓鉗制,分辨測量膜電流,稱為細胞貼附膜片。由于不破壞細胞的完整性,這種方式又稱為細胞膜上的膜片記錄。此時跨膜電位由玻管固定電位和細胞電位決定。因此,為測定膜片兩側的電位,需測定細胞膜電位并從該電位減去玻管電位。從膜片的通道活動看,這種形式的膜片是極穩(wěn)定的,因細胞骨架及有關代謝過程是完整的,所受的干擾小。膜片鉗技術是用玻璃微電極吸管把只含1-3個離子通道、面積為幾個平方微米的細胞膜通過負壓吸引封接起來。高通量全自動膜片鉗電生理工具
實驗溶液浸溶細胞溶液和微電極玻璃管內的填充液成分對全細胞膜片鉗記錄也是很重要的內容,這關系到封接的容易程度、細胞存活狀態(tài)及膜電位的狀態(tài)等。在實驗記錄過程中,尤其是神經生物學實驗,需要迅速更換細胞浸溶液濃度以免受體敏感性降低(desensitization)或需要模擬快速突觸反應的壽命。原則上細胞的浸溶液成分或玻璃管內填充液成分應該與細胞外或細胞內間質的成分相似,實際研究中,為了探討某些通道或電位特性,對這些實驗溶液的成分或濃度會作必要調整,沒有哪種溶液是理想的。進口單電極膜片鉗多少錢典型的單通道電流呈一種振幅相同而持續(xù)時間不等的脈沖樣變化。
對藥物作用機制的研究,在通道電流記錄中,可分別于不同時間、不同部位(膜內或膜外)施加各種濃度的藥物,研究它們對通道功能的可能影響,了解那些選擇性作用于通道的藥物影響人和動物生理功能的分子機理。這是目前膜片鉗技術應用普遍的領域,既有對西藥藥物機制的探討,也普遍用在重要藥理的研究上。如開麗等報道細胞貼附式膜片鉗單通道記錄法觀測到人參二醇組皂苷可控制正常和“缺血”誘導的大鼠大腦皮層神經元L-型鈣通道的開放,從而減少鈣內流,對缺血細胞可能有保護作用。陳龍等報道采用細胞貼附式單通道記錄法發(fā)現烏頭堿對培養(yǎng)的Wistar大鼠心室肌細胞L-型鈣通道有阻滯作用。
Flip-Tip翻轉技術、將一定密度的細胞懸液灌注在玻璃電極中,下降到電極前列的單個細胞通過在電極外施加負壓可以與玻璃電極前列形成穩(wěn)定的高阻封接,打破露在玻璃電極前列開口外的細胞膜就形成了全細胞記錄模式。德國Flyion公司的Flyscreen8500系統(tǒng)采用的就是這一技術,其通量比較高為6,即一次可同時記錄6個細胞。它的***特點是∶(1)仍然采用玻璃毛坯作為電極(2)藥物施加微量、快速。SealChip技術;完全摒棄了玻璃電極,而是采用SealChip平面電極芯片一定密度的細胞懸液灌注在芯片上面,隨機下降到芯片上約1-2μm的孔上并在自動負壓的吸引下形成高阻封接,打破孔下面的細胞膜形成全細胞記錄模式。采用這一技術的美國Axon(MDS)公司的PatchXpress7000A系統(tǒng)是高通量全自動膜片鉗技術的典范,是離子通道藥物研發(fā)的**性工具,在國外實驗室和制藥廠***用于hERG通道藥理學的研究。其通量比較高為16,即一次可同時記錄16個細胞同時,其藥物施加微量、快速,不僅用于藥物篩選,還大量用于離子通道的基礎研究。脂質層電導很低,由于雙分子層的結構特點,形成了細胞的膜電容,通道蛋白開閉狀況主要決定了膜電導的數值。
膜片鉗技術是神經科學領域非常重要的一項技術,1976年由國馬普生物物理研究所Neher和Sakmann發(fā)明,從而在活細胞上記錄到單個離子通道的電流。近半個世紀來,膜片鉗技術已經成為神經科學領域較常用也是較實用的技術之一,具有極大的精確性和靈活性,能夠揭示離子通道,單細胞突觸反應,及神經環(huán)路連接等多層次的電生理特性。做過膜片鉗的人都知道,膜片鉗的信號采集設備一般由前置放大器,放大器,模數/數模轉換器等構成,神經元電信號先通過前置放大器(headstage)初步放大,后傳輸入放大器進一步放大,再傳入模數轉換器轉化為數字信號,后被計算機采集。下圖顯示的是我們較常使用的AXON和HEKA膜片鉗的一個信號傳輸路徑。全細胞膜片鉗記錄是應用較早,也是普遍的鉗位技術。日本可升級膜片鉗技術
神經遞質的釋放、腺體的分泌、肌肉的運動、學習和記憶。高通量全自動膜片鉗電生理工具
膜片鉗技術本質上也屬于電壓鉗范疇,兩者的區(qū)別關鍵在于:①膜電位固定的方法不同;②電位固定的細胞膜面積不同,進而所研究的離子通道數目不同。電壓鉗技術主要是通過保持細胞跨膜電位不變,并迅速控制其數值,以觀察在不同膜電位條件下膜電流情況。因此只能用來研究整個細胞膜或一大塊細胞膜上所有離子通道活動。目前電壓鉗主要用于巨大細胞的全性能電流的研究,特別在分子克隆的卵母細胞表達電流的鑒定中發(fā)揮著其他技術不能替代的作用。該技術的主要缺陷是必須在細胞內插入兩個電極,對細胞損傷很大,在小細胞如元,就難以實現,又因細胞形態(tài)復雜,很難保持細胞膜各處生物特性的一致。高通量全自動膜片鉗電生理工具
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