對(duì)于兩個(gè)遠(yuǎn)距離(相距1-2mm以上)的成像部位，通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像；對(duì)于相鄰區(qū)域，通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_，這可以通過(guò)事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來(lái)解決。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法；時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲，使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)可以暫時(shí)分離。引入的光束越多，可以成像的神經(jīng)元越多，但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加，從而限制了分辨信號(hào)源的能力；并且復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來(lái)維持單束的信噪比，這樣容易導(dǎo)致組織損傷。OCT可以用于損傷修復(fù)監(jiān)測(cè)。Yeh等用OCT、多光子顯微鏡。美國(guó)清醒動(dòng)物多光子顯微鏡單分子成像定位

2020年，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱(chēng)為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦，會(huì)聚角為Δθ。光束進(jìn)入到一對(duì)幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S，偏角為α。經(jīng)過(guò)反射鏡多次反射后，激光脈沖被分成多個(gè)傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α），脈沖間以2S/c的時(shí)間延遲（c，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過(guò)FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿(mǎn)物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。美國(guó)高速高分辨率多光子顯微鏡飛秒激光未來(lái)國(guó)產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大。

1，光源、光路高度整合通過(guò)精密的設(shè)計(jì)，將飛秒激光器、掃描振鏡、PMT、濾光片組，甚至是單光子熒光光路全套整合在一個(gè)不大的掃描頭（ScanHead）內(nèi)，無(wú)論掃描頭如何移動(dòng)，掃描頭內(nèi)的光路都可以保持穩(wěn)定不變，從而實(shí)現(xiàn)了超穩(wěn)定、免維護(hù)的特點(diǎn)。2，配合多維度、高精度機(jī)械控制系統(tǒng)。掃描頭直接架設(shè)在一個(gè)多維運(yùn)動(dòng)的機(jī)械裝置上，可沿任意方向和角度移動(dòng)掃描頭，方便對(duì)動(dòng)物樣本進(jìn)行多方位的掃描觀察。而這在常規(guī)方案的多光子顯微鏡上有很大的實(shí)現(xiàn)難度，不但需要多個(gè)關(guān)節(jié)組合的光路導(dǎo)向機(jī)構(gòu)，并且在這些關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)的時(shí)候，都冒著極大的光路偏移的風(fēng)險(xiǎn)，以至于在使用一段時(shí)間后都需要對(duì)光路進(jìn)行再次校準(zhǔn)，而這樣的問(wèn)題在我司上則完全不會(huì)發(fā)生。3.一機(jī)多能。

從產(chǎn)品類(lèi)型及技術(shù)方面來(lái)看，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場(chǎng)。2020年，全球多光子激光掃描正置顯微鏡市場(chǎng)達(dá)到87.30百萬(wàn)美元，預(yù)計(jì)到2027年該部分市場(chǎng)將達(dá)到154.02百萬(wàn)美元，年復(fù)合增長(zhǎng)率（2021-2027）為8.48%。中國(guó)多光子激光掃描正置顯微鏡市場(chǎng)達(dá)到13.32百萬(wàn)美元，預(yù)計(jì)到2027年該部分市場(chǎng)將達(dá)到25.21百萬(wàn)美元，年復(fù)合增長(zhǎng)率（2021-2027）為9.58%。從產(chǎn)品市場(chǎng)應(yīng)用情況來(lái)看，研究機(jī)構(gòu)為主要應(yīng)用領(lǐng)域，2020年約占全球市場(chǎng)46.28%。2020年，全球多光子激光掃描顯微鏡研究機(jī)構(gòu)應(yīng)用消費(fèi)量為174臺(tái)，預(yù)計(jì)2027年達(dá)到349臺(tái)，2021-2027年復(fù)合增長(zhǎng)率（CAGR）為9.72%。全球多光子顯微鏡主要廠商基本情況介紹，包括公司簡(jiǎn)介、多光子顯微鏡產(chǎn)品型號(hào)、產(chǎn)量、產(chǎn)值及動(dòng)態(tài)等。

細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng)，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過(guò)程中Ca2+熒光信號(hào)的變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過(guò)程中，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過(guò)程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過(guò)程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等等，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很強(qiáng)的變化。多光子共聚焦掃描顯微鏡比雙光子共聚焦掃描顯微鏡具有更高的空間分辨率。美國(guó)進(jìn)口多光子顯微鏡焦點(diǎn)激發(fā)

多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內(nèi)制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)。美國(guó)清醒動(dòng)物多光子顯微鏡單分子成像定位

雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點(diǎn):a.光損傷小:雙光子熒光顯微以可見(jiàn)光或近紅外光為激發(fā)光，對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小，適合長(zhǎng)期研究；b.穿透力強(qiáng):與紫外光、可見(jiàn)光或近紅外光相比，穿透力強(qiáng)，可用于生物樣品的深入研究；c.高分辨率:由于雙光子吸收截面很小P，熒光只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā)，雙光子吸收被限制在焦點(diǎn)λ左右的體積內(nèi)；d.漂白區(qū)域很小，焦點(diǎn)外不發(fā)生漂白。E.高熒光收集率與共焦成像相比，雙光子成像不需要濾光片，提高了熒光收集率。采集效率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高。F.對(duì)探測(cè)光路要求低。由于激發(fā)光和發(fā)射熒光的波長(zhǎng)差越來(lái)越大，加上自發(fā)三維濾波效應(yīng)，多光子顯微鏡對(duì)光路采集系統(tǒng)的要求遠(yuǎn)低于單光子共焦顯微鏡，光學(xué)系統(tǒng)也相對(duì)簡(jiǎn)單。G.適用于多標(biāo)簽復(fù)合測(cè)量許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜比單光子激發(fā)光譜更寬，從而可以用單一波長(zhǎng)的激發(fā)光同時(shí)激發(fā)多種染料，獲得同一生命現(xiàn)象的不同信息，便于相互比較和補(bǔ)充。美國(guó)清醒動(dòng)物多光子顯微鏡單分子成像定位

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