多光子顯微鏡成像深度深、對(duì)比度高，在生物成像中具有重要意義，但通常需要較高的功率。結(jié)合時(shí)間傳播的超短脈沖可以實(shí)現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度，但近紅外波段的光本身會(huì)導(dǎo)致分辨率較低?；诙喙庾由限D(zhuǎn)換材料和時(shí)間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)是由清華大學(xué)教授和北京大學(xué)彭研究員合作開發(fā)的?？蓪?shí)現(xiàn)50MHz的超高掃描速度，突破衍射極限，實(shí)現(xiàn)超分辨率成像。與普通熒光顯微鏡相比，該顯微鏡經(jīng)過改進(jìn)，只需要較低的激發(fā)功率。這種超快、低功耗、多光子超分辨率技術(shù)在高分辨率生物深層組織成像中具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。多光子顯微鏡的成熟的深部組織成像技術(shù)中。還有其他類型的圖像對(duì)比提供有關(guān)樣本的有價(jià)值信息。美國(guó)熒光多光子顯微鏡多光子激發(fā)

快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動(dòng)透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描，但可調(diào)電動(dòng)透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段。在LSU模塊中，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來擴(kuò)大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。多光子顯微鏡成像精度多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內(nèi)制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

繼首代小型化雙光子顯微鏡在國(guó)際上獲得小鼠自由行為過程中大腦神經(jīng)元和突觸的動(dòng)態(tài)圖像后，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡。它具有更大的成像視野和三維成像能力，可以清晰穩(wěn)定地對(duì)自由活動(dòng)小鼠三維腦區(qū)的數(shù)千個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行成像，實(shí)現(xiàn)對(duì)同一批神經(jīng)元的一個(gè)月追蹤記錄。通過對(duì)微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì)系統(tǒng)的。微物鏡工作距離延長(zhǎng)至1mm，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)成像。內(nèi)嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實(shí)時(shí)成像。該掃描模塊由一個(gè)快速的電動(dòng)變焦透鏡和一對(duì)中繼透鏡組成，在不同深度成像時(shí)可保持放大倍率恒定。其變焦模塊重量，研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探頭可整體即時(shí)拔插，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，避免了長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)動(dòng)物的干擾。在重復(fù)裝卸探頭同一批神經(jīng)元時(shí)，視場(chǎng)旋轉(zhuǎn)角小于，邊界偏差小于35微米。

多光子激光掃描顯微鏡的產(chǎn)業(yè)發(fā)展，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要分布在德國(guó)和日本，德國(guó)以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為基礎(chǔ)，日本以尼康和奧林巴斯為基礎(chǔ)。2020年以來，這些企業(yè)占據(jù)了全球多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的64.44%，它們的發(fā)展策略影響著多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的走向。目前，世界市場(chǎng)對(duì)多光子激光掃描顯微鏡的需求正在增長(zhǎng)，中國(guó)市場(chǎng)的需求增長(zhǎng)更快。未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的發(fā)展在中國(guó)將仍有巨大的發(fā)展?jié)摿?。?guó)內(nèi)市場(chǎng)多光子顯微鏡銷售渠道。

    對(duì)于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素，而對(duì)于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng)；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng)，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力?？焖費(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。 多光子共聚焦掃描顯微鏡比雙光子共聚焦掃描顯微鏡具有更高的空間分辨率。美國(guó)bruker多光子顯微鏡單分子成像定位

多光子顯微鏡的大多數(shù)補(bǔ)償器都采用棱鏡。美國(guó)熒光多光子顯微鏡多光子激發(fā)

對(duì)于兩個(gè)遠(yuǎn)距離(相距1-2mm以上)的成像部位，通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像；對(duì)于相鄰區(qū)域，通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_，這可以通過事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來解決。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法；時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲，使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)可以暫時(shí)分離。引入的光束越多，可以成像的神經(jīng)元越多，但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加，從而限制了分辨信號(hào)源的能力；并且復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來維持單束的信噪比，這樣容易導(dǎo)致組織損傷。美國(guó)熒光多光子顯微鏡多光子激發(fā)

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