與傳統(tǒng)的單光子寬場熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡(MPM)具有光學切片和深度成像的功能，極大地促進了研究人員對整個大腦深部神經的認識。2019年，JeromeLecoq等從腦深部神經元成像、大數量神經元成像、高速神經元成像三個方面討論了相關的MPM技術。為了將神經元活動與復雜行為聯系起來，通常需要對大腦皮層深處的神經元進行成像，這就要求MPM具備深度成像的能力。激發(fā)光和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收，這是限制MPM成像深度的主要因素。雖然增加激光強度可以解決散射問題，但會帶來其他問題，如燒焦樣品、散焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發(fā)光。另外，對于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。多光子顯微鏡，助力科研人員深入探索生命科學的奧秘。高速高分辨率多光子顯微鏡數據采集

光學成像技術與分子生物學技術的結合為研究上述科學問題提供了條件與可能。因此，在現代分子生物學技術基礎上，急需發(fā)展新的成像技術。在動物體內，如何實現基因表達及蛋白質之間相五作用的實時在體成像監(jiān)測是當前迫切需要解決的重大科學技術問題。這是也生物學、信息科學（光學）和基礎臨床醫(yī)學等學科共同感興趣的重大問題。對這-一一科學問題的研究不僅有助于闡明生命活動的基本規(guī)律、認識疾病的發(fā)展規(guī)律，而且對創(chuàng)新藥物研究、藥物療效評價以及發(fā)展疾病早期診斷技術等產生重大影響。熒光多光子顯微鏡應用滔博生物多光子顯微鏡是一種高級的顯微鏡技術.

多光子顯微鏡成像深度深、對比度高，在生物成像中具有重要意義，但通常需要較高的功率。結合時間傳播的超短脈沖可以實現超快的掃描速度和較深的成像深度，但近紅外波段的光本身會導致分辨率較低?；诙喙庾由限D換材料和時間編碼結構光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)是由清華大學教授和北京大學彭研究員合作開發(fā)的?？蓪崿F50MHz的超高掃描速度，突破衍射極限，實現超分辨率成像。與普通熒光顯微鏡相比，該顯微鏡經過改進，只需要較低的激發(fā)功率。這種超快、低功耗、多光子超分辨率技術在高分辨率生物深層組織成像中具有長遠的應用前景。

對于雙光子(2P)成像，散焦和近表面熒光激發(fā)是兩個相對較大的深度限制因素，而對于三光子(3P)成像，這兩個問題**減少。  然而，由于熒光團的吸收截面遠小于2P，三光子成像需要更高的脈沖能量才能獲得與2P相同激發(fā)強度的熒光信號。  功能性3P顯微鏡比結構性3P顯微鏡要求更高，后者需要更快的掃描速度以便及時采樣神經元活動。  為了在每個像素的停留時間內收集足夠的信號，需要更高的脈沖能量。  復雜的行為通常涉及大規(guī)模的大腦神經網絡，這些網絡既有本地連接，也有遠程連接。  為了將神經元的活動與行為聯系起來，需要同時監(jiān)測* * *分布的超大型神經元的活動。  大腦中的神經網絡將在幾十毫秒內處理輸入的刺激。  為了理解這種快速神經元動力學，MPM需要快速成像神經元的能力。  快速MPM方法可分為單束掃描技術和多束掃描技術。  雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術。

快速光柵掃描有多種實現方式，使用振鏡進行快速2D掃描，將振鏡和可調電動透鏡結合在一起進行快速3D掃描，但可調電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換，影響成像速度，現可使用空間光調制器（SLM）代替。遠程聚焦也是一種實現3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調控M的位置實現軸向掃描。該技術不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經元成像，可以通過調整顯微鏡的物鏡設計來擴大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠程聚焦、SLM和可調電動透鏡。精確測量細胞結構與功能，多光子顯微鏡技術走在科技前沿。美國模塊化多光子顯微鏡成像分辨率

多光子顯微鏡是一種高分辨率的顯微鏡技術，利用多光子激發(fā)熒光的原理來觀察生物樣品的細胞結構和功能。高速高分辨率多光子顯微鏡數據采集

1，光源、光路高度整合通過精密的設計，將飛秒激光器、掃描振鏡、PMT、濾光片組，甚至是單光子熒光光路全套整合在一個不大的掃描頭（ScanHead）內，無論掃描頭如何移動，掃描頭內的光路都可以保持穩(wěn)定不變，從而實現了超穩(wěn)定、免維護的特點。2，配合多維度、高精度機械控制系統(tǒng)。掃描頭直接架設在一個多維運動的機械裝置上，可沿任意方向和角度移動掃描頭，方便對動物樣本進行多方位的掃描觀察。而這在常規(guī)方案的多光子顯微鏡上有很大的實現難度，不但需要多個關節(jié)組合的光路導向機構，并且在這些關節(jié)旋轉的時候，都冒著極大的光路偏移的風險，以至于在使用一段時間后都需要對光路進行再次校準，而這樣的問題在我司上則完全不會發(fā)生。3.一機多能。高速高分辨率多光子顯微鏡數據采集