雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點(diǎn):a.光損傷小:雙光子熒光顯微以可見(jiàn)光或近紅外光為激發(fā)光,對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小,適合長(zhǎng)期研究;b.穿透力強(qiáng):與紫外光、可見(jiàn)光或近紅外光相比,穿透力強(qiáng),可用于生物樣品的深入研究;c.高分辨率:由于雙光子吸收截面很小P,熒光只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā),雙光子吸收被限制在焦點(diǎn)λ左右的體積內(nèi);d.漂白區(qū)域很小,焦點(diǎn)外不發(fā)生漂白。E.高熒光收集率與共焦成像相比,雙光子成像不需要濾光片,提高了熒光收集率。采集效率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高。F.對(duì)探測(cè)光路要求低。由于激發(fā)光和發(fā)射熒光的波長(zhǎng)差越來(lái)越大,加上自發(fā)三維濾波效應(yīng),多光子顯微鏡對(duì)光路采集系統(tǒng)的要求遠(yuǎn)低于單光子共焦顯微鏡,光學(xué)系統(tǒng)也相對(duì)簡(jiǎn)單。G.適用于多標(biāo)簽復(fù)合測(cè)量許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜比單光子激發(fā)光譜更寬,從而可以用單一波長(zhǎng)的激發(fā)光同時(shí)激發(fā)多種染料,獲得同一生命現(xiàn)象的不同信息,便于相互比較和補(bǔ)充。精確測(cè)量細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能,多光子顯微鏡技術(shù)走在科技前沿。美國(guó)多光子顯微鏡成像區(qū)域
細(xì)胞在受到外界刺激時(shí),隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng),即使刺激繼續(xù)存在,Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng),反而會(huì)減弱,直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過(guò)程中Ca2+熒光信號(hào)的變化情況,研究發(fā)現(xiàn),配了在粘著過(guò)程中,Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化,而配子之間發(fā)生融合作用時(shí),Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值,并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象,對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過(guò)程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過(guò)程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等,Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很強(qiáng)的變化。高速高分辨率多光子顯微鏡研究更多關(guān)于多光子顯微鏡的信息有哪些?
現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步,特別是隨著后基因組時(shí)代的到來(lái),人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型,為在體研究基因表達(dá)規(guī)律、分子間的相互作用、細(xì)胞的增殖、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)分化、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件。然而,盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法,已經(jīng)對(duì)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入、細(xì)致的研究,但仍然不能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。在細(xì)胞的生理過(guò)程中,基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾和相萬(wàn)作用往往發(fā)生可逆的、動(dòng)態(tài)的變化。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化,但獲取這些信息對(duì)與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要。因此,發(fā)展能用于、動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)、連續(xù)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的方法非常必要。
多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展,世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國(guó)和日本,德國(guó)是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為,而日本以尼康和奧林巴斯公司為,2020年,上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)64.44%的市場(chǎng)份額,其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的走向。目前世界市場(chǎng)對(duì)多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長(zhǎng),中國(guó)市場(chǎng)這方面的需求增長(zhǎng)更快,未來(lái)五年多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的發(fā)展在中國(guó)將具有很大的發(fā)展?jié)摿?。多光子顯微鏡是一種用于生物學(xué)領(lǐng)域的分析儀器。
Ca2+是重要的第二信使,對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有極其重要的作用,開(kāi)發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對(duì)Ca2+熒光信號(hào)進(jìn)行觀測(cè),可以從某些方面對(duì)有機(jī)體或細(xì)胞的變化機(jī)制進(jìn)行分析,具有重要的意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細(xì)胞內(nèi)用熒光探針標(biāo)記的Ca2*的時(shí)間和空間的熒光圖像的變化,還可以觀察細(xì)胞某一層面或局部的(Ca2+)熒光圖像和變化。通過(guò)對(duì)單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),Ca2+不僅在細(xì)胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的,而且細(xì)胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差。多光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用,可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)分布、細(xì)胞活動(dòng)等。美國(guó)共聚焦多光子顯微鏡飛秒激光
雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。美國(guó)多光子顯微鏡成像區(qū)域
對(duì)于雙光子(2P)成像而言,離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素,而對(duì)于三光子(3P)成像這兩個(gè)問(wèn)題大大減小,但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多,所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高,它需要更快速的掃描,以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng);需要更高的脈沖能量,以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來(lái),需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng),大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激,要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué),就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力??焖費(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。 美國(guó)多光子顯微鏡成像區(qū)域